运铁蛋白-肿瘤抑素融合蛋白质及其生成和使用方法技术

本发明专利技术提供了重组蛋白及其生成和使用方法，所述重组蛋白包括连接到肿瘤抑素或其他抗血管生成蛋白的运铁蛋白。本发明专利技术还提供了能够表达所述重组蛋白的表达系统、质粒和细胞及其生产和使用方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2011年8月17日提交的美国临时申请N0.61/524，508的优先权权益，此文整体附此作参考。专利
本专利技术涉及重组蛋白及其生成和使用方法，所述重组蛋白包括连接到肿瘤抑素或其他抗血管生成蛋白的运铁蛋白。本专利技术还涉及能够表达所述重组蛋白的表达系统及其生产和使用方法。专利技术背景脉络膜新生血管(Choroidal neovascularization, CNV)是指脉络膜血管系统的不受控生长，它会在诸如弹性假黄色瘤、血管样条纹症、组织胞浆菌病、点状内层脉络膜病变、湿性年龄相关黄斑变性(AMD)等疾病中导致严重视觉丧失。湿性AMD在玻璃疣(补体成分、脂质和载脂蛋白)淀积引起受限缺血性区域，造成低氧时发生。据信，低氧导致血管内皮生长因子(VEGF)分泌增加，其活化脉络膜内皮细胞分泌基体金属蛋白酶(MMP)。金属蛋白酶降解细胞外基质，以此允许内皮细胞增殖及其向视网膜迁移。最后，MMP的作用造成新血管或CNV的形成，其能引起视网膜脱离和出血及由于血液和脂质泄漏所致的视网膜下损伤形成。在证实后，CNV是工业化国家的老年人群中视觉丧失的主要原因。当前CNV的治疗限于患者群体的一部分，并且聚焦于抑制VEGF在血管通透性过高(hyperpermeability)和新血管形成中的有害作用。然而，VEGF还在诸如伤口愈合、光感受器存活和脉络膜毛细管床的维护等生理活动中起建设性的关键作用。当前，Ranibizumab (Lucentis?), Aflibercept (Eylea?)和 pegaptanib (Macugen?)是仅有的两种目前为止批准用于治疗CNV的治疗剂。这些药剂抑制VEGF。已经表明，在治疗CNV方面ranibizumab 一般比 pegaptanib 更有效。Ranibizumab 与 VEGF-A 所有的同种型(isoform)结合，并抑制VEGF活性，包括血管通透性和生长。除两种提及的治疗剂外，还探索了贝伐珠单抗(Avastin?) (ranibizumab的亲本全长抗体)作为针对CNV的标签外(off label)治疗。尽管这些治疗在治疗CNV中获得成功，但在这些治疗上有固有的缺点，包括在活化的内皮细胞中缺乏凋亡和VEGF相关生理活动诸如伤口愈合的潜在损害。另外，ranibizumab的使用导致全身性危险,包括人玻璃体内给药之后的血栓栓塞事件率增大。玻璃体内贝伐珠单抗还与缺血性发作、血压升高、脑血管事故和死亡相联系。另外，在CNV患者的临床试验中，对ranibizumab的响应率在CNV患者中只有约40%，而且来信数目增加(gain in number of letters)仅为 7.2。 因此，需要新的和/或更有效的用于治疗CNV的治疗方法，其具有降低的副作用和/或更好的治疗功效。专利技术概述本专利技术的某些方面提供重组蛋白，其包括连接到肿瘤抑素或其他类似的抗血管生成蛋白的运铁蛋白。在某些实施方案中，运铁蛋白和肿瘤抑素彼此直接连接。在其他实施方案中，运铁蛋白和肿瘤抑素彼此通过接头共价连接。适用的接头对于本专业技术人员是众所周知的。[0011 ] 本专利技术的其他方面提供质粒，其包括编码包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白的核酸序列。通常，编码重组蛋白的核酸序列可操作连接到表达控制序列。本专利技术的再其他方面提供重组核酸分子，其包括编码重组蛋白的核酸序列，所述重组蛋白包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白。在某些实施方案中，核酸序列可操作连接到表达控制序列。本专利技术的再其他方面提供用重组核酸分子转染并表达重组核酸分子的重组宿主细胞，所述重组核酸分子包括编码重组蛋白的核酸序列，所述重组蛋白包含连接到肿瘤抑素的运铁蛋白。本专利技术其他方面提供一种用于生成包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白的方法，所述方法包括:用重组核酸分子转染重组宿主细胞，所述重组核酸分子包括编码包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白的核酸序列；在足以产生包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白的条件下，培养转染的宿主细胞；并将该重组蛋白以基 本上纯化的重组蛋白回收。在某些实施方案中，重组蛋白包括直接连接到肿瘤抑素的运铁蛋白。本专利技术的再其他方面提供一种用于治疗受试者中与脉络膜新生血管(chOToidalneovascularization, CNV)有关的临床状况的方法，所述方法包括对需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的重组蛋白，该重组蛋白包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白。在某些实施方案中，与CNV相联系的临床状况包括弹性假黄色瘤、血管样条纹症、组织胞浆菌病、点状内层脉络膜病变或湿性年龄相关黄斑变性(AMD)。本专利技术的成份还可以用来治疗诸如但是不限于癌症；癌症关联新血管化；角膜血管发生；增生性糖尿病性视网膜病变；新血管性(neovascular)青光眼；其他新血管性和血管性增生性眼病症；以及身体其它地方的其他新血管性和血管性增生性病症。本专利技术的组合物可以利用对于本领域技术人员已知的任何方法给药，包括但是不限于玻璃体内、静脉内、脉络膜上、表面、眼周、皮下、肌肉内、视网膜下、眼球后、巩膜内等。附图简述图1是表示运铁蛋白-肿瘤抑素、贝伐珠单抗和肿瘤抑素的抗增殖活性的图；图2是表示用不同浓度的肿瘤抑素、运铁蛋白-肿瘤抑素和贝伐珠单抗蛋白对在脉络膜内皮细胞中观察到的内皮管形成的抑制的图；图3是表示BN大鼠CNV损伤大小的体内评估的柱状图；图4是运铁蛋白-肿瘤抑素持续性基因表达构建体的图示。专利技术详述本专利技术的某些方面提供包含连接(亦即，附着)到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白。运铁蛋白可以直接或间接(例如，通过接头)连接到肿瘤抑素。本专利技术其他方面提供重组核酸分子，其包括编码包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白的核酸序列。本专利技术的再其他方面提供用重组核酸分子转染并表达该重组核酸分子的重组宿主细胞，该重组核酸分子包括编码重组蛋白的核酸序列，该重组蛋白包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白。本专利技术的再其他方面提供用于生成和使用重组蛋白的方法，所述重组蛋白包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白。肿瘤抑素已经表明在治疗CNV上是治疗有效的。不受任何理论束缚，据信肿瘤抑素具有通过引起凋亡从而使血管发生消退的能力，即一种在当前CNV治疗中缺乏的特性。肿瘤抑素是一种内源性血管发生抑制剂，它最初从存在于基底膜中的胶原IV的C端非胶原域(NCl)获得。据信，肿瘤抑素通过结合ανβ3整联蛋白，阻止内皮细胞增生和另外通过诱使内皮细胞凋亡，起抑制血管形成作用。在不存在任何病理条件的情况下，在血管生成分子(诸如VEGF)和抗血管生成分子(诸如肿瘤抑素)之间维持平衡。在低氧和缺血的过程中，在血管生成分子和抗血管生成分子之间的平衡据信被干扰，因此引起新血管化。与肿瘤抑素一样的血管发生抑制剂是人体对抗新血管化的固有机制的一部分。肿瘤抑素比起ranibizumab和贝伐珠单抗具有许多优点，而且据信治疗上优于这些抗体。至今，肿瘤抑素受体，即ανβ 3整联蛋白，只在活化的内皮细胞上，而不在正常的血管上发现。因而，据信，肿瘤抑素提供一个在不影响诸如伤口愈合等生理过程情况下通往靶向活化的内皮细胞的途径。肿瘤抑素促进内皮细胞凋亡，并据信由肿瘤抑素所引起的凋亡可以造成增生血管的消退，并因而在恢复正常视觉中本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组蛋白，其包括连接到肿瘤抑素(tumstatin)的运铁蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.08.17 US 61/524,5081.重组蛋白，其包括连接到肿瘤抑素(tumstatin)的运铁蛋白。2.权利要求1的重组蛋白，其中运铁蛋白和肿瘤抑素彼此直接连接。3.权利要求1的重组蛋白，其中运铁蛋白和肿瘤抑素彼此通过接头共价连接。4.质粒，其包括编码包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白的核酸序列。5.权利要求4的质粒，其中所述编码重组蛋白的核酸序列可操作连接到表达控制序列。6.重组核酸分子，其包括编码包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白的核酸序列。7.权利要求6的重组核酸分子，其中所述核酸序列可操作连接到表达控制序列。8.重组宿主细胞，其用重组核酸分子转染并且表达该重组核酸分子，所述重组核酸分子包括编码包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白的核酸序列。9.一种用于生成包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白的方法，所述方法包括: 用重组核酸分子转染重组宿主细胞，所述重组核酸分子包括编码包括连接到肿瘤...

【专利技术属性】
技术研发人员：U·B·科姆佩拉，R·I·沙因曼，P·泰亚吉，
申请(专利权)人：科罗拉多大学董事会法人团体，
类型：发明
国别省市：美国;US