一种利用BiFC指示细胞中Wnt信号活性状态的载体组合物及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种利用BiFC指示细胞中Wnt信号活性状态的系统及应用。本发明专利技术提供了一种融合蛋白组，由融合蛋白A和融合蛋白B组成，所述融合蛋白A包括核心效应因子β-catenin片段和位于其C段的荧光蛋白片段A；所述融合蛋白B包括转录因子TCF和位于其N段的荧光蛋白片段B。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术利用依据双分子荧光互补技术(BiFC)的策略将Wnt信号通路中核心效应因子β-catenin与转录因子TCF形成的复合体可视化，从而直接显示Wnt在细胞中的活性状态，本发明专利技术将BiFC系统瞬时转染细胞或构建成稳定表达细胞系，可观察到细胞核中形成的特异信号，该信号可以特异显示并反映活细胞中Wnt信号通路活性状态及其变化。

【技术实现步骤摘要】
—种利用B i FC指示细胞中Wnt信号活性状态的载体组合物及应用
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种利用BiFC指示细胞中Wnt信号活性状态的载体组合物及应用。
技术介绍
经典的Wnt信号通路是一条保守而重要的信号转导通路，与胚胎发育、成体组织稳态、癌症发生都有着密切联系。在多种癌症中，例如结直肠癌、乳腺癌、肺癌、皮肤癌等等，都已经检测到因为通路成员突变等多种原因造成的fct信号的异常激活。因此，对Wnt信号通路的研究以及以fct信号为靶点的药物筛选都具有非常重要的意义。关于经典Wnt信号的工作模式，目前人们认为，当fct信号被激活时，降解复合体的功能被抑制，使得β-catenin得以在细胞质中积累，进而入核与转录因子TCF结合一同激活下游靶基因的转录。近年来，已经有许多基因被鉴定为fct信号通路靶基因，这些基因在细胞增殖、细胞存活、细胞代谢等多个领域都发挥着重要作用。因此，β-catenin与TCF家族成员(TCF1、LEFU TCF3、TCF4)发生相互作用形成复合体被认为是Wnt信号过程中的关键步骤，成为fct信号转录调控的重要开关。该关键步骤也被认为是药物筛选的重要靶点之一 O为了显示Wnt 信号在细胞内的活性状态，人们专利技术了多种方法。T0PFLASH报告系统便是一种广泛应用的方法，该系统可通过报告基因荧光素酶的表达显示fct靶基因的转录输出状态。在双分子荧光互补技术(BiFC)系统中，荧光蛋白被截成N段、C段两部分，分别与两个目标蛋白构建为融合蛋白。单独的荧光蛋白片段本身不能发出荧光，并且在细胞空间范围内随机接近的几率很小。只有当两个目标蛋白之间发生相互作用时，才可以拉近荧光蛋白片段，有利于它们重组成完整的荧光蛋白进而发出荧光，如图1所示。BiFC可用于观测活细胞内蛋白分子间的相互作用，也可以通过其荧光定位显示互作发生的位置。BiFC在多种物种的细胞组织中均能使用，例如在哺乳动物细胞、植物组织、线虫等多种系统中都具有可行性。BiFC信号可在普通显微镜下进行检测，不需要特殊分析手段。BiFC系统可以在较低的蛋白水平下检测到荧光，并且只需要两个荧光蛋白片段之间具有一定的结构上的柔性。总体来说，BiFC为显示活细胞内蛋白之间的相互作用提供了直接、便捷、高精度的技术手段。目前，还没有报道利用BiFC技术显示β-catenin水平及下游水平的蛋白互作情况。
技术实现思路
本专利技术的一个目的地是提供一种用于检测细胞内Wnt信号活性状态的融合蛋白组。本专利技术提供的融合蛋白组，由融合蛋白A和融合蛋白B组成:所述融合蛋白A包括β -catenin的C端缺失片段和位于其C段的荧光蛋白片段A；所述融合蛋白B包括转录因子TCF和位于其N段的荧光蛋白片段B ；[0011 ] 所述β -catenin的C端缺失片段为β -catenin蛋白氨基酸序列N末端起第2-667个氨基酸残基。上述的融合蛋白组中，所述融合蛋白A从N端起依次由所述β -catenin的C端缺失片段、连接肽和荧光蛋白片段A组成；所述融合蛋白B从N端起依次由所述转录因子TCF、连接肽和荧光蛋白片段B组成；所述荧 光蛋白片段A和所述荧光蛋白片段B来源于同一个荧光蛋白或不同荧光蛋白。上述的融合蛋白组中，所述TCF 为 TCF1、TCF2、TCF3、TCF4 或其转录变体。所述连接肽的氨基酸序列为序列表中序列2 ；所述荧光蛋白为EYFP和/或Venus荧光蛋白；所述荧光蛋白片段A为Venus蛋白氨基酸残基自N末端第155-238位氨基酸或EYFP蛋白氨基酸残基自N末端第159-238位氨基酸；[0021 ] 所述荧光蛋白片段B为Venus蛋白氨基酸残基自N末端第1_173位氨基酸或EYFP蛋白氨基酸残基自N末端第1-158位氨基酸。上述的融合蛋白组中，所述融合蛋白A从N端起依次由所述β -catenin的C端缺失片段、连接肽和荧光蛋白片段A组成；所述荧光蛋白片段A为Venus蛋白氨基酸残基自N末端第155-238位氨基酸；所述融合蛋白B从N端起依次由所述转录因子TCF3、连接肽和荧光蛋白片段B组成；所述荧光蛋白片段B为EYFP蛋白氨基酸残基自N末端第1-158位氨基酸；所述融合蛋白A的氨基酸序列具体为序列表中的序列8 ；所述融合蛋白B的氨基酸序列具体为序列表中的序列14。本专利技术的另一个目的是提供DNA分子组。本专利技术提供的DNA分子组，其由编码融合蛋白A的DNA分子A和编码融合蛋白B的DNA分子B组成,所述DNA分子A的核苷酸序列为序列表中序列7 ;所述DNA分子B的核苷酸序列为序列表中序列13。本专利技术第三个目的是提供重组载体组。本专利技术提供的重组载体组，由表达融合蛋白A的重组载体和表达融合蛋白B的重组载体组成；所述表达融合蛋白A的重组载体为将所述编码融合蛋白A的DNA分子插入表达载体得到的载体；所述表达融合蛋白B的重组载体为将所述编码融合蛋白B的DNA分子插入表达载体得到的载体。上述表达载体具体为pcDNA3.1-FLAG, pcDNA3.1-Myc 或 pBI。本专利技术第四个目的是提供一种转基因细胞系。本专利技术提供的转基因细胞系，为将所述表达融合蛋白A的重组载体和所述表达融合蛋白B的重组载体共同导入宿主细胞中得到的细胞系。上述融合蛋白组、上述的DNA分子组、上述的重组载体组或权利要求7所述的转基因细胞系在利用BiFC检测影响细胞Wnt信号的物质中的应用也是本专利技术保护的范围；或上述融合蛋白组、上述的DNA分子组、上述的重组载体组或上述的转基因细胞系在利用BiFC检测细胞中Wnt活性状态中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术第五个目的是提供一种利用BiFC检测或鉴定影响细胞内Wnt信号的物质的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤:将小分子物质作用上述的转基因细胞系，检测处理后的转基因细胞系，若处理转基因细胞系的BiFC荧光信号比处理前转基因细胞系强，则所述小分子物质为激活细胞内fct信号的物质； 若处理转基因细胞系的BiFC荧光信号比处理前转基因细胞系弱，则所述小分子物质为抑制细胞内fct信号的物质；所述小分子物质具体为导致TCF缺失的干扰RNA、GSK3 β、E_cadherin、LiCl、BIO、NC043 或 SRSFl 蛋白。上述作用的方式如下:若是蛋白或核酸，则作用为将含有蛋白编码基因或含有核酸的重组载体转染到所述转基因细胞中；若小分子物质为化合物，则作用为将所述化合物加入转基因细胞培养基中。本专利技术第六个目的是提供一种用于检测细胞内fct信号活性状态的方法。本专利技术提供的方法，将所述表达融合蛋白A的重组载体和所述表达融合蛋白B的重组载体共同导入宿主细胞，得到转基因细胞，观察转基因细胞，若有荧光产生，表明激活细胞中的fct信号，若无荧光产生，表明未激活细胞中的Wnt信号，实现可视化观察细胞中的fct信号活性状态或变化。本专利技术的实验证明，本专利技术利用双分子荧光互补技术(BiFC)的策略将Wnt信号通路中核心效应因子β -catenin与转录因子TCF形成的复合体可视化,从而直接显示Wnt在细胞中的活性状态，本专利技术将BiFC系统瞬时转染细胞，可观察到细胞核中形成的特异信号，该信号可以特异显示并反映活细胞中fct信号通路活性状态及其变化。因此，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测细胞内Wnt信号活性状态的融合蛋白组，由融合蛋白A和融合蛋白B组成：所述融合蛋白A包括β‑catenin的C端缺失片段和位于其C段的荧光蛋白片段A；所述融合蛋白B包括转录因子TCF和位于其N段的荧光蛋白片段B；所述β‑catenin的C端缺失片段为β‑catenin蛋白氨基酸序列N末端起第2‑667个氨基酸残基。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测细胞内Wnt信号活性状态的融合蛋白组，由融合蛋白A和融合蛋白B组成: 所述融合蛋白A包括β-catenin的C端缺失片段和位于其C段的荧光蛋白片段A ; 所述融合蛋白B包括转录因子TCF和位于其N段的荧光蛋白片段B ； 所述β -catenin的C端缺失片段为β -catenin蛋白氨基酸序列N末端起第2-667个氨基酸残基。2.根据权利要求1所述的融合蛋白组，其特征在于: 所述融合蛋白A从N端起依次由所述β -catenin的C端缺失片段、连接肽和突光蛋白片段A组成； 所述融合蛋白B从N端起依次由所述转录因子TCF、连接肽和荧光蛋白片段B组成； 所述荧光蛋白片段A和所述荧光蛋白片段B来源于同一个荧光蛋白或不同荧光蛋白。3.根据权利要求2所述的融合蛋白组，其特征在于:所述TCF为TCF1、TCF2、TCF3、TCF4或其转录变体。 所述连接肽的氨基酸序列为序列表中序列2 ； 所述荧光蛋白为EYFP和/或Venus荧光蛋白； 所述荧光蛋白片段A为Venus蛋白氨基酸残基自N末端第155-238位氨基酸或EYFP蛋白氨基酸残基自N末端第159-238位氨基酸； 所述荧光蛋白片段B为Venus蛋白氨基酸残基自N末端第1-173位氨基酸或EYFP蛋白氨基酸残基自N末端第1-158位氨基酸。4.根据权利要求3所述的融合蛋白组，其特征在于: 所述融合蛋白A从N端起依次由所述β -catenin的C端缺失片段、连接肽和突光蛋白片段A组成；所述荧光蛋白片段A为Venus蛋白氨基酸残基自N末端第155-238位氨基酸；所述融合蛋白B从N端起依次由所述转录因子TCF3、连接肽和荧光蛋白片段B组成；所述荧光蛋白片段B为EYFP蛋白氨基酸残基自N末端第1-158位氨基酸； 所述融合蛋白A的氨基酸序列具体为序列表中的序列8 ； 所述融合蛋白B的氨基酸序列具体为序列表中的序列14。5.DNA分子组，其由编码融合蛋白A的DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴畏，丁雅洁，汤玮欣，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11