本发明专利技术主要涉及一种OPN关联蛋白基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法，该方法包括：重组克隆载体TA-pro-MMP-9的构建、重组表达质粒pET-28a(+)-pro-MMP-9的构建和pro-MMP-9蛋白的诱导表达与鉴定。本发明专利技术通过建立原核生物基因表达系统，可以大量表达pro-MMP-9，并建立高纯度蛋白纯化流程，获得量多、纯度高且制备方法简单可行的pro-MMP-9蛋白。
【技术实现步骤摘要】
OPN关联蛋白pro-MMP-9基因的克隆及表达
本专利技术属于基因克隆表达
，具体涉及一种OPN下游关联蛋白基质金属蛋白酶9酶原基因的克隆及表达的方法。
技术介绍
胰腺癌是一种恶性程度很高的肿瘤。在我国，胰腺癌发病率呈逐步上升趋势，是导致人口死亡的十大恶性肿瘤之一，未经治疗者一年生存率大约20%，5年生存率不到4%。侵袭(invasion)和转移(metastasis)是目前胰腺癌患者治疗失败的主要原因。骨桥蛋白(osteopontin,0PN)是一种具有多种功能分泌型|丐结合磷酸化糖蛋白。近年研究发现，OPN在胰腺癌肿瘤细胞中呈高表达，并与胰腺癌的侵袭和转移密切相关。因此，对其作用机制及信号通路的研究也显得极为重要。基质金属蛋白酶-9 (matrix metal1proteinases 9, MMP-9)是金属蛋白酶家族的重要成员之一，具有多种生物学功能:降解基底膜和细胞外基质，激活生长因子，促进细胞迁移。多种文献报道⑴⑵，基质金属蛋白酶-9在肿瘤细胞中高表达，与肿瘤迁移密切相关。基质金属蛋白酶-9通常以酶原形式存在，从胞内分泌到胞外，当酶原激活后方具有生物学功能。而最近研究显示(3)，在胰腺癌中，OPN可能通过激活MMP-9而促进胰腺癌的侵袭和转移。因此，基质金属蛋白酶 _9 酶原(pro-matrix metal1proteinases 9，pro-MMP-9)的研究显得非常关键。基质金属蛋白酶-9酶原作为分泌型蛋白，在细胞外作用，含量极少，从生物体中直接纯化得率低，操作繁琐，成本也高，不能满足工业化生产的需要。参考文献: 1.HemaRangaswamij Anuradha Bulbulej and Gopal C.Kundu.NuclearFactor-1nducing Kinase Plays a Crucial Role in Osteopontin-1nduced MAPK/1κ B aKinase-dependent Nuclear Factor κ B-mediated Promatrix Metalloproteinase-9Activation.(2004) J.Biol.Chem.279:38921 - 35 2.Durlik M， Gardian K Metalloproteinase 2 and 9 activity in thedevelopment of pancreatic cancer.(2012) Pol Przegl Chir.84:377-82.3.Collins AL， Rock J， Malhotra L， Frankel WLj Bloomston M.0steopontinexpression is associated with improved survival in patients with pancreaticadenocarcinoma.(2012) Ann Surg Oncol.19:2673-8.
技术实现思路
本专利技术提供一种克隆、表达并分离纯化OPN关联蛋白基质金属蛋白酶-9酶原(pro-MMP-9)蛋白质的方法，该方法包含:重组克隆载体TA-pro-MMP-9的构建、重组表达质粒pET-28a(+)-pro-MMP-9的构建和pro-MMP-9蛋白的诱导表达与鉴定。进一步地，所述的基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法中，重组克隆载体TA-pro-MMP-9的构建具体分为以下步骤: 1).pro-MMP-9的引物设计: 以pET28a (+) -pro-MMP-9为模板，通过拼接PCR扩增pro-MMP-9，设计出4条引物pro-MMP-9pl>pro-MMP-9p2>pro-MMP-9pl-G_3，、pro-MMP-9p2-G_5，, 上游引物pro-MMP-9p I含有内切酶位点Nde I，下游引物pro-MMP_9p2含有内切酶位点Hind III，pro-MMP-9pl:5’ -CGCATATGGCCATGGTGTACTGAG-3’pro-MMP-9pl-G-3>:5’ -GTATCATAATGCTCCGGATACATTAGA-3’pro-MMP-9p2-G-5>:5’ -AGCCTGATGAAACTCGCAATTCTGTA-3’pro-MMP-9p2:5’ -CGAAGCTTTGCGATGATAGATGTCACAC-3’ ； 2).拼接PCR扩增pro-MMP-9基因片段 以pET28a (+) -pro-MMP-9为模板，通过拼接PCR扩增pro-MMP-9基因片段，先扩增NdeI与pro-MMP-9基因第66碱基中间的片段和pro-MMP-9基因第54-285位碱基序列，上述PCR产物用凝胶电泳，切胶后用胶回收试剂盒回收目的片段，再拼接PCR扩增Nde I_mE7序列； 3).TA克隆连接与转化 取pMD18-T载体，加入 延伸过A的pro-MMP-9片段，再加入连接缓冲液，连接； 将上述TA连接产物转移到DH5 α感受态细胞中转化，即得TA阳性克隆。进一步地，所述的基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法中，重组表达质粒pET-28a(+)-pro-MMP-9的构建具体分为以下步骤: 0.酶切与回收目标片段:pro-MMP-9基因序列中有I酶切位点，用I/HindIII双酶切TA- pro-MMP-9及pET_28a(+)质粒，然后回收目标片段； 2).T4 DNA连接酶连接及转化:在连接体系中连接过夜，然后将连接产物转入DH5a感受态，培养过夜即得阳性克隆。进一步地，所述的基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法中，pro-MMP-9蛋白的诱导表达与鉴定具体分为以下步骤: 0.重组质粒转化大肠杆菌:将上述鉴定为阳性的重组质粒pET-28a(+)-pro-MMP-9转入感受态Rosetta，涂布于LB — Kan+平板上，培养过夜； 2).1PTG诱导蛋白表达:挑单克隆于LB - Kan+中，培养过夜，然后接过夜菌于LB —Kan+中，继续培养，然后加入IPTG诱导蛋白表达。进一步地，所述的基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法中，所述的方法中还包括pro-MMP-9蛋白的纯化和鉴定: 0.细菌蛋白表达形式的分析:_80°C冻存菌体:加入细菌裂解液，超声破菌后离心，包涵体沉淀在底部，分别取上清、包涵体做SDS-PAGE，结果显示pro-MMP-9蛋白主要存在于包涵体中； 2).pro-MMP-9蛋白的纯化:超声破菌后，离心弃上清，沉淀超声洗涤，将溶解有包涵体的溶液离心，取上清上样至预先平衡好的镍柱，分别用溶液洗涤10个柱床体积，再用洗脱缓冲液洗脱，收集蛋白液，充分透析，离心取上清液，收获的蛋白用SDS-PAGE进行纯度分析；3).pro-MMP-9蛋白的鉴定:SDS_PAGE电泳结束后取下凝胶，电转到硝酸纤维素膜上，取膜，于室温用5%脱脂奶粉封闭，加入鼠抗人pro-MMP-9抗体，室温孵育，用PBST洗膜，加入羊抗鼠抗体室温孵育，再用PBST洗膜，加入底物液显色，在暗室内显影、定影，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种OPN关联蛋白基质金属蛋白酶‑9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征在于，该方法包含：重组克隆载体TA‑pro‑MMP‑9的构建、重组表达质粒pET‑28a(+)‑pro‑MMP‑9的构建和pro‑MMP‑9蛋白的诱导表达与鉴定。
【技术特征摘要】
1.一种OPN关联蛋白基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征在于，该方法包含:重组克隆载体TA-pro-MMP-9的构建、重组表达质粒pET-28a(+) -pro-MMP-9的构建和pro_MMP-9蛋白的诱导表达与鉴定。2.根据权利要求1所述的基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征在于，重组克隆载体TA-pro-MMP-9的构建具体分为以下步骤: 1).pro-MMP-9的引物设计: 以pET28a (+) -pro-MMP-9为模板，通过拼接PCR扩增pro-MMP-9，设计出4条引物pro-MMP-9pl>pro-MMP-9p2>pro-MMP-9pl-G_3，、pro-MMP-9p2-G_5，， 上游引物pro-MMP-9p I含有内切酶位点Nde I，下游引物pro-MMP_9p2含有内切酶位点Hind III，pro-MMP-9pl:5’ -CGCATATGGCCATGGTGTACTGAG-3’pro-MMP-9pl-G-3>:5’ -GTATCATAATGCTCCGGATACATTAGA-3’pro-MMP-9p2-G-5>:5’ -AGCCTGATGAAACTCGCAATTCTGTA-3’pro-MMP-9p2:5’ -CGAAGCTTTGCGATGATAGATGTCACAC-3’ ； 2).拼接PCR扩增pro-MMP-9基因片段 以pET28a (+) -pro-MMP-9为模板，通过拼接PCR扩增pro-MMP-9基因片段，先扩增NdeI与pro-MMP-9基因第66碱基中间的片段和pro-MMP-9基因第54-285位碱基序列，上述PCR产物用凝胶电泳，切胶后用胶回收试剂盒回收目的片段，再拼接PCR扩增Nde I_mE7序列； 3).TA克隆连接与转化 取pMD18-T载体，加入延伸过A的pro-MMP-9片段，再加入连接缓冲液，连接； 将上述TA连接产物转移到DH5 α感受态细胞中转化，即得TA阳性克隆。3.根据权利要求1所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈爱萍，蒋晟，梁静，顾传虎，姚洛芫，
申请(专利权)人：南京优科制药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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