OPN关联蛋白pro-MMP-9基因的克隆及表达制造技术

本发明专利技术主要涉及一种OPN关联蛋白基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法，该方法包括：重组克隆载体TA-pro-MMP-9的构建、重组表达质粒pET-28a(+)-pro-MMP-9的构建和pro-MMP-9蛋白的诱导表达与鉴定。本发明专利技术通过建立原核生物基因表达系统，可以大量表达pro-MMP-9，并建立高纯度蛋白纯化流程，获得量多、纯度高且制备方法简单可行的pro-MMP-9蛋白。

【技术实现步骤摘要】
OPN关联蛋白pro-MMP-9基因的克隆及表达
本专利技术属于基因克隆表达
，具体涉及一种OPN下游关联蛋白基质金属蛋白酶9酶原基因的克隆及表达的方法。
技术介绍
胰腺癌是一种恶性程度很高的肿瘤。在我国，胰腺癌发病率呈逐步上升趋势，是导致人口死亡的十大恶性肿瘤之一，未经治疗者一年生存率大约20%，5年生存率不到4%。侵袭(invasion)和转移(metastasis)是目前胰腺癌患者治疗失败的主要原因。骨桥蛋白(osteopontin,0PN)是一种具有多种功能分泌型|丐结合磷酸化糖蛋白。近年研究发现，OPN在胰腺癌肿瘤细胞中呈高表达，并与胰腺癌的侵袭和转移密切相关。因此，对其作用机制及信号通路的研究也显得极为重要。基质金属蛋白酶-9 (matrix metal1proteinases 9, MMP-9)是金属蛋白酶家族的重要成员之一，具有多种生物学功能:降解基底膜和细胞外基质，激活生长因子，促进细胞迁移。多种文献报道⑴⑵，基质金属蛋白酶-9在肿瘤细胞中高表达，与肿瘤迁移密切相关。基质金属蛋白酶-9通常以酶原形式存在，从胞内分泌到胞外，当酶原激活后方具有生物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种OPN关联蛋白基质金属蛋白酶‑9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征在于，该方法包含：重组克隆载体TA‑pro‑MMP‑9的构建、重组表达质粒pET‑28a(+)‑pro‑MMP‑9的构建和pro‑MMP‑9蛋白的诱导表达与鉴定。

【技术特征摘要】
1.一种OPN关联蛋白基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征在于，该方法包含:重组克隆载体TA-pro-MMP-9的构建、重组表达质粒pET-28a(+) -pro-MMP-9的构建和pro_MMP-9蛋白的诱导表达与鉴定。2.根据权利要求1所述的基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征在于，重组克隆载体TA-pro-MMP-9的构建具体分为以下步骤: 1).pro-MMP-9的引物设计: 以pET28a (+) -pro-MMP-9为模板，通过拼接PCR扩增pro-MMP-9，设计出4条引物pro-MMP-9pl>pro-MMP-9p2>pro-MMP-9pl-G_3，、pro-MMP-9p2-G_5，， 上游引物pro-MMP-9p I含有内切酶位点Nde I，下游引物pro-MMP_9p2含有内切酶位点Hind III，pro-MMP-9pl:5’ -CGCATATGGCCATGGTGTACTGAG-3’pro-MMP-9pl-G-3>:5’ -GTATCATAATGCTCCGGATACATTAGA-3’pro-MMP-9p2-G-5>:5’ -AGCCTGATGAAACTCGCAATTCTGTA-3’pro-MMP-9p2:5’ -CGAAGCTTTGCGATGATAGATGTCACAC-3’ ； 2).拼接PCR扩增pro-MMP-9基因片段 以pET28a (+) -pro-MMP-9为模板，通过拼接PCR扩增pro-MMP-9基因片段，先扩增NdeI与pro-MMP-9基因第66碱基中间的片段和pro-MMP-9基因第54-285位碱基序列，上述PCR产物用凝胶电泳，切胶后用胶回收试剂盒回收目的片段，再拼接PCR扩增Nde I_mE7序列； 3).TA克隆连接与转化 取pMD18-T载体，加入延伸过A的pro-MMP-9片段，再加入连接缓冲液，连接； 将上述TA连接产物转移到DH5 α感受态细胞中转化，即得TA阳性克隆。3.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈爱萍，蒋晟，梁静，顾传虎，姚洛芫，
申请(专利权)人：南京优科制药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32