半衰期延长的人因子IX变体制造技术

说明了糖基化位点数目增加的因子IX变体。所述因子IX变体的半衰期延长和/或回收提高。

【技术实现步骤摘要】
半衰期延长的人因子IX变体本申请是2008年10月15日提交的题为“半衰期延长的人因子IX变体”的国家申请号为200880122214.9 (PCT/US2008/011754)的专利技术专利申请的分案申请。优先权声明根据35U.S.C.§ 119(e)，本专利申请要求2007年10月15日提交的美国临时专利申请N0.60/999035的权益，该申请的全部内容以其全部形式作为参考并入本文。
本专利技术涉及包含附加的糖基化位点的因子IX变体，以及编码该因子IX变体的核酸构建体。
技术介绍
_5] 相关技术的说明可商购的因子IX有血浆来源的产品(Mononine? )和重组蛋白(Benefix?)。Mononine?的缺点在于传播通过由纯化步骤所带有的细菌和病毒(例如HIV,肝炎病毒)污染而造成的疾病的可能。重组蛋白(例如Benefix? )的使用避免了这些问题。然而，在实验动物模型系统和人的静脉内(1.v.)弹丸注入后，重组因子IX(r因子IX，例如Benefix? )的药物动力学性质比人血浆来源的因子IX(Pd因子IX，例如Mononine?) 的性质差。由于r因子IX不够良好的药物动力学性质，因此一般r因子IX的剂量需要高20-30%以达到与pd因子IX相同的促凝血活性水平(White等，(Apri11998), Seminars inHematology, vol.35, n0.2Suppl.2:33-38 ；Roth 等,(Decemberl5, 2001) Blood vol.98 (13):3600-3606)。已证实向蛋白中添加糖基化位点是延长它们半衰期的重要工具。例如，达贝泊汀-a (Darbepoetin-α )是红细胞生成素的重组形式，其中添加了两个附加的N-连接糖基化位点(Elliott 等，Enhancement of therapeutic protein in vivo activitiesthrough glycoengineering, Nat Biotechnol.(2003)21:414-421)。为了产生达贝泊汀，将残基30和32突变产生一个糖基化位点，并且将残基87、88和90突变产生第二糖基化位点。具有这两个附加糖基化位点的达贝泊汀的半衰期是正常红细胞生成素的三倍；此外，它的安全性与红细胞生成素没有差别。尽管达贝泊汀分子具有5个氨基酸的变化，但是自2004年以来,未鉴别出对达贝泊汀的抗体发展的病例(Smalling等,“Drug-1nducedand antibody-mediated pure red cell aplasia:a review of literature and currentknowledge”，Biotechnol Annu Rev.(2004) 10:237-250 ；Sinclair 等，“Glycoengineering:the effect of glycosylation on the properties of therapeutic protein，，，J Pharm Sc1.(2005)94:1626-1635) o添加neo-糖基化位点也延长了痩素(Ieptin)和MpI配体的半衰期。本专利技术涉及生产具有附加的糖基化位点的因子IX(FIX)变体。该重组因子IX变体的回收值更高和/或半衰期更长从而使得可以向对象施用较低剂量和/或较低频次的因子IX。专利技术简述本专利技术提供了与野生型因子IX相比，包含一个或多于一个附加的糖基化位点的分离的因子IX(FIX)变体。可以通过以下方式的任意组合来引入所述一个或多个附加的糖基化位点:附加的氨基酸的插入、氨基酸的缺失、氨基酸的取代和/或氨基酸的重排。也可以通过定点突变和/或FIX变体的化学合成引入所述一个或多个附加的糖基化位点。在一些实施方式中，该附加的糖基化位点中的至少一个位于激活肽(activationpeptide)之内。该FIX变体可以包含插入至SEQ IDNO:33所示的人FIX氨基酸序列的N157和N167位置之间的肽片段，并且所述肽片段可以包含约3至约100个氨基酸残基。所述肽片段可以包含小鼠因子IX激活肽的至少一部分(例如，图1，第4行)并且可以修饰所述小鼠激活肽以增加糖基化位点数目(例如图1，第2和3行)。本专利技术所述的FIX蛋白变体可以是人FIX蛋白。本专利技术所述变体FIX的一个或多个附加的糖基化位点可以是N-连接糖基化位点、O-连接糖基化位点以及N-连接糖基化位点和O-连接糖基化位点的组合。在一些实施方式中，糖基化位点可以包括N-连接糖基化位点，所述N-连接糖基化位点包含共有序列NXT / S，条件是X不是脯氨酸。在其他实施方式中，该糖基化位点包括O-连接糖基化位点，所述O-连接糖基化位点包含选自以下的共有序列:CXXGGT / S-C (SEQID NO:9)、NSTE / DA (SEQ ID NO:10)、NITQS (SEQ ID NO:11)、QSTQS (SEQ ID NO:12)、D/E-FT^R/K-V (SEQ ID NO:13)、C-E / D-SN (SEQ ID NO:14)、GGSC-K / R (SEQ ID NO:15)以及它们的任意组合。此外,本专利技术所述的FIX变体可以包含约I至约5个附加的糖基化位点。本专利技术还提供了包含编码本专利技术所述FIX变体的核苷酸序列的载体，包含本专利技术所述载体的转化的细胞以及包含本专利技术所述FIX变体的转基因动物。在一些实施方式中，本专利技术所述FIX变体的至少一个附加的糖基化位点可以位于激活肽之外。此外，本专利技术所述FIX变体的至少一个附加的糖基化位点可以对应于在FIX的非人同源物的天然形式中被糖基化的位点，其中非人同源物可以是，例如，狗、猪、牛或小鼠。本专利技术还提供了增加因子IX蛋白中糖基化位点数目的方法，包括:a)将第一 FIX氨基酸序列与第二 FIX氨基酸序列比对；b)鉴别存在于所述第一 FIX氨基酸序列而不存在于所述第二氨基酸序列中的糖基化位点；c)修饰所述第二 FIX氨基酸序列以引入糖基化位点，该糖基化位点对应于步骤(b)中在第一 FIX氨基酸序列中鉴别出的糖基化位点，其中修饰所述第二 FIX氨基酸序列增加了 FIX蛋白中的糖基化位点数目。在本专利技术的方法中，第一 FIX氨基酸序列可以来自非人类物种，而第二氨基酸序列可以是人FIX。在这些方法的进一步实施方式中，第一FIX氨基酸序列中的糖基化位点可以位于激活肽之内或激活肽之外。这些方法还包括在所述激活肽之内和所述激活肽之外均添加一个或多个糖基化位点。 本专利技术还提供分离的FIX变体，与野生型FIX相比，该变体包含一个或多个附加的糖链。在一些实施方式中，通过化学和/或酶方法将所述一个或多个附加的糖链添加到FIX蛋白上。通过以下附图，本专利技术的其他方面、特征和优势将变得显而易见。【附图说明】现在将参考下列附图对本专利技术的这些和其他特征进行说明，这些附图旨在说明而并非限制本专利技术。图1显示了人因子IX变体。第I行:人因子IX (SEQ IDNO:5);第2行:具有小鼠激活肽(AP)片段的人因子IX，其中未修饰小鼠AP片段(SEQ ID NO:2);第3行:具有添加了一个本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的因子IX(FIX)蛋白变体，其与野生型因子IX相比包含一个或多于一个附加的糖基化位点。

【技术特征摘要】
2007.10.15 US 60/999,0351.分离的因子IX(FIX)蛋白变体，其与野生型因子IX相比包含一个或多于一个附加的糖基化位点。2.根据权利要求1所述的FIX变体，其中所述一个或多于一个附加的糖基化位点中至少有一个位于激活肽中。3.根据权利要求1所述的FIX变体，其包含插入至SEQID NO:33所示的人FIX氨基酸序列的N157和N167位置间的肽片段。4.根据权利要求3所述的FIX变体，其中所述肽片段包含3-100个氨基酸残基。5.根据权利要求4所述的FIX变体，其中所述肽片段包含小鼠因子IX激活肽的至少一部分。6.根据权利要求5所述的FIX变体，其中修饰了所述小鼠激活肽以增加糖基化位点数目。7.根据权利要求1所述的FIX变体，其中所述一个或多于一个附加的糖基化位点选自N-连接糖基化位点、O-连接糖基化位点以及N-连接糖基化位点和O-连接糖基化位点的组合。8.根据权利要求7所述的FIX变体，其中所述糖基化位点包含N-连接糖基化位点，所述N-连接糖基化位点包含共有序列NXT / S，条件是X不为脯氨酸。9.根据权利要求7所述的FIX变体，其中所述糖基化位点包含O-连接糖基化位点，所述O-连接糖基化位点包含选自以下的共有序列:CXXGGT / S-C (SEQ ID NO:9)、NSJE /DA(SEQ ID NO:10),NITQS(SEQ ID NO:11),QSTQS(SEQ ID NO:12)、D / E-FTzR / K-V(SEQ IDNO:13)、C-E / D-SN(SEQ ID NO:14)、GGSC-K / R(SEQ ID NO:15)和它们的任意组合。10.根据权利要求1-9中任一项所述的FIX变体，其包含1-5个附加的糖基化位点。11.载体，其包含编码根据权利要求1-10中任一项所述的FIX变体的核苷酸序列。12.转化的细胞，其包含根据权利要求11所述的载体。13.转基...

【专利技术属性】
技术研发人员：DW斯坦福德，DM曼，D冯，
申请(专利权)人：北卡罗来纳查佩尔山大学，肯杰尼公司，
类型：发明
国别省市：美国;US