热稳定酶组合物制造技术

本发明专利技术涉及包括至少两种选自内切葡聚糖酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶和α－半乳糖苷酶组成的组的热稳定酶的组合物。这些热稳定酶具有的解链温度Ｔｍ至少为７０℃。优选的组合物包括第１１族糖苷水解酶家中的木聚糖酶和与来源于橙色热子囊菌的热稳定糖苷水解酶家第５族的内切葡聚糖酶同源的内切葡聚糖酶。优选的木聚糖酶来源于曲霉属、芽孢杆菌属、腐质霉属、噬热霉属和木霉属。该组合物特别用于动物饲料目的。可选的其它成分为维生素、矿物质和抗微生物肽类。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
热稳定酶组合物专利
本专利技术涉及包括至少两种热稳定酶的组合物，所述的热稳定酶选自下列酶组成的组：内切葡聚糖酶(endoglucanase)、木聚糖酶(xylanase)、肌醇六磷酸酶(phytase)、蛋白酶、半乳聚糖酶(galactanase)、甘露聚糖酶(mannanase)、葡聚糖酶(dextranase)和α-半乳糖苷酶；本专利技术还涉及该组合物的制备方法及其应用，特别涉及动物饲料。专利技术背景来源于细毛噬热霉的热稳定木聚糖酶(SEQ ID NO：14)公开在WO96/23062中。将来源于橙色热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)IFO 9748的内切-β-1，4-葡聚糖酶的氨基酸序列于2001年9月10日提供给NCBI EntrezProtein Database(保藏号GenPept AAL 16412.1)。热稳定肌醇六磷酸酶的实例是WO99/48380的30页中所列的下面粗体撰写的各种共有肌醇六磷酸酶。专利技术概述本专利技术涉及包括至少两种热稳定酶的组合物，所述的热稳定酶选自下列酶组成的组：内切葡聚糖酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶和α-半乳糖苷酶。本专利技术还涉及这类组合物的制备方法、它们在动物饲料中的应用、它们在处理植物蛋白中的应用及含有它们的动物饲料组合物。专利技术详述尽管固体形式的酶在某种程度上可以使用保护涂层(protective coatings)等而防止受到加热破坏，但是仍需要具有高内在热稳定性的液体酶(本身是热稳定酶)，特别是为了动物饲料目的。许多动物饲料酶制品是通过对各种微生物进行深层发酵而获得的多成分酶制品。不过，也可以得到通过重组DNA技术制备的大量单一成分饲料-->酶。单一成分饲料酶可以比传统多成分酶制品具有一定优势。本专利技术提供了改进的酶组合物，特别涉及动物饲料领域。在本文的上下文中，表达方式“酶”和“具有酶活性的多肽”可以互换使用。热稳定酶就本专利技术的目的而言，术语热稳定指的是多肽具有使用示差扫描量热法(DSC)在5.0-7.0区间的一个pH下测定的至少70℃的解链温度Tm。在具体的实施方案中，Tm至少为71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、77.5℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或至少为100℃。在可选的实施方案中，Tm至少为64℃、65℃、66℃、67℃、68℃或至少为69℃。为了测定Tm，可以使用具有如通过SDS-PAGE测定的至少90％(或91、92、93、94、95、96、97或98％)纯度的酶样品。进一步说，这种酶样品可以具有如根据280nm处的吸收度测定且基于根据所述酶氨基酸序列计算的消光系数的0.5-2.5mg/ml蛋白质(或0.6-2.4或0.7-2.2或0.8-2.0mg/ml蛋白质)的浓度。可以在pH5.0-7.0区间的任意pH值、例如pH7.0(例如在10mM磷酸盐、50mM NaCl的缓冲液中)下或在pH6.5、6.0、5.5或5.0下并使用例如1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9和10℃/分钟的恒定加热速率进行DSC。当使用本文实施例6中所述的设备时，优选的加热速率的实例为1.0、1.5或2.0℃/分钟。对使用小样体积的其它类型设备而言，可以使用例如3、4、5、6、7、8、9或10℃/分钟的加热速率或20、30、40、50乃至达60℃/分钟的加热速率估计Tm。酶组合物本专利技术的组合物包括至少两种酶，它们选自热稳定内切葡聚糖酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶和α-半乳糖苷酶。在具体的实施方案中，该组合物包括属于这些类型酶中的两种、三种、-->四种、五种、六种、七种或全部八种的热稳定酶。可以包括每种类型中一种以上的酶，例如一种、两种、三种、四种等。本专利技术的具体组合物包括至少两种热稳定酶，它们选自内切葡聚糖酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶和半乳聚糖酶组成的组。这类组合物的实例为：内切葡聚糖酶和木聚糖酶；内切葡聚糖酶和肌醇六磷酸酶；内切葡聚糖酶和半乳聚糖酶；木聚糖酶和肌醇六磷酸酶；木聚糖酶和半乳聚糖酶；肌醇六磷酸酶和半乳聚糖酶；内切葡聚糖酶、木聚糖酶和肌醇六磷酸酶；内切葡聚糖酶、木聚糖酶和半乳聚糖酶；内切葡聚糖酶、肌醇六磷酸酶和半乳聚糖酶；木聚糖酶、肌醇六磷酸酶和半乳聚糖酶；内切葡聚糖酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶和半乳聚糖酶。在优选的实施方案中，将这些组合物与至少一种蛋白酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶和/或α-半乳糖苷酶合并。本专利技术其它具体的组合物包括至少两种热稳定酶，它们选自内切葡聚糖酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶和半乳聚糖酶组成的组。本专利技术其它具体的组合物包括至少两种热稳定酶，它们选自内切葡聚糖酶、木聚糖酶和肌醇六磷酸酶组成的组。这类组合物的实例为：内切葡聚糖酶和木聚糖酶；内切葡聚糖酶和肌醇六磷酸酶；木聚糖酶和肌醇六磷酸酶；内切葡聚糖酶、木聚糖酶和肌醇六磷酸酶。在优选的实施方案中，将这些组合物与至少一种半乳聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶和/或α-半乳糖苷酶合并。进一步说，本专利技术其它具体的组合物包括下列热稳定酶：内切葡聚糖酶和木聚糖酶；内切葡聚糖酶和蛋白酶；内切葡聚糖酶、木聚糖酶和肌醇六磷酸酶；内切葡聚糖酶、木聚糖酶和蛋白酶；内切葡聚糖酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶和蛋白酶；木聚糖酶和肌醇六磷酸酶；木聚糖酶和蛋白酶；肌醇六磷酸酶和蛋白酶；肌醇六磷酸酶、蛋白酶和半乳聚糖酶；木聚糖酶、肌醇六磷酸酶和蛋白酶；木聚糖酶、蛋白酶和半乳聚糖酶；肌醇六磷酸酶和半乳聚糖酶；半乳聚糖酶和蛋白酶；肌醇六磷酸酶、半乳聚糖酶和α-半乳糖苷酶；肌醇六磷酸酶和α-半乳糖苷酶；蛋白酶和α-半乳糖苷酶；半乳聚糖酶和α-半乳糖苷酶；半乳聚糖酶、蛋白酶和α-半乳糖苷酶。在这些组合物中，下面是特别有用的膳食的饲料添加剂：(a)基于玉米和大豆的膳食：肌醇六磷酸酶和蛋白酶；肌醇六磷酸酶、蛋白酶和半乳聚糖酶；(b)基于小麦和大豆的膳食：木聚糖酶和蛋白酶；半乳聚糖酶、蛋白-->酶和木聚糖酶；(c)基于小麦-大麦和大豆的膳食：木聚糖酶、β葡聚糖酶和蛋白酶；木聚糖酶、β葡聚糖酶和肌醇六磷酸酶；基于大麦和大豆的膳食：β-葡聚糖酶和蛋白酶。酶的EC类型-Bernard Henrissat糖苷水解酶(glycolside hydrolase)族可以基于来自NC-IUBMB，1992)的酶命名法手册对酶进行分类，另外参见国际互联网上的ENZYME网站：http：//www.expasy.ch/enzyme/。ENZYME是有关酶命名法的信息库。它主要基于国际生物化学和分子生物学联合会(IUB-MB)的推荐且它记载了已经提供EC(酶委员会)号的每种类型的特征化酶(Bairoch A.The ENZYME数据库，2000，Nucleic Acids Res 28：304-305)。这种IUB-MB酶命名法基于其底物特异性，而有时基于其分子机理；这类分类并不反映这些酶的结构特征。几年以前已经提出了基于氨基酸序列相似性的家族中的某些糖苷本文档来自技高网...

【技术保护点】
组合物，包括至少两种选自内切葡聚糖酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶和α－半乳糖苷酶组成的组的热稳定酶，其中正如在５．０－７．０区间的ｐＨ下通过示差扫描量热法所测定的，所述热稳定酶中的每一种具有的解链温度Ｔｍ至少为７０℃。

【技术特征摘要】
DK 2002-1-25 PA2002001301.组合物，包括至少两种选自内切葡聚糖酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶和α-半乳糖苷酶组成的组的热稳定酶，其中正如在5.0-7.0区间的pH下通过示差扫描量热法所测定的，所述热稳定酶中的每一种具有的解链温度Tm至少为70℃。2.权利要求1所述的组合物，包括下列热稳定酶：(i)内切葡聚糖酶和木聚糖酶；(ii)内切葡聚糖酶和蛋白酶；(iii)内切葡聚糖酶、木聚糖酶和肌醇六磷酸酶；(iv)内切葡聚糖酶、木聚糖酶和蛋白酶；(v)内切葡聚糖酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶和蛋白酶；(vi)木聚糖酶和肌醇六磷酸酶；(vii)木聚糖酶和蛋白酶；(viii)肌醇六磷酸酶和蛋白酶；(ix)肌醇六磷酸酶、蛋白酶和半乳聚糖酶；(x)木聚糖酶、肌醇六磷酸酶和蛋白酶；(xi)木聚糖酶、蛋白酶和半乳聚糖酶；(xii)肌醇六磷酸酶和半乳聚糖酶；(xiii)半乳聚糖酶和蛋白酶；(xiv)肌醇六磷酸酶、半乳聚糖酶和α-半乳糖苷酶；(xv)肌醇六磷酸酶和α-半乳糖苷酶；(xvi)蛋白酶和α-半乳糖苷酶；(xvii)半乳聚糖酶和α-半乳糖苷酶；(xviii)半乳聚糖酶、蛋白酶和α-半乳糖苷酶；或(xix)内切葡聚糖酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶和半乳聚糖酶中的至少两种。3.权利要求1-2中任意一项所述的组合物，包括：(i)至少一种具有木聚糖酶活性的多肽，该多肽属于第11族糖苷水解酶；和(ii)至少一种具有内切葡聚糖酶活性的多肽，该多肽包括：(a)与SEQ ID NO：2的第1-335或第31-335位氨基酸具有至少75％同一性的氨基酸序列；和/或其中所述多肽是(b)由在低严格条件下与如下成分杂交的核酸序列编码：(i...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴文平，丹彼得森，克劳斯C富格尔桑，
申请(专利权)人：DSMIP资产公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]