一种非生物学筛选抗病毒中药有效成分的方法技术

本发明专利技术公开了一种非生物学筛选抗病毒中药有效成分的方法。该方法以流感病毒的特效药物奥司他韦（OS）为模板分子，以丙烯酰胺和4-乙烯基吡啶为功能单体，合成非共价的奥司他韦分子印迹聚合物（OS-MIP），以此为固定相湿法装填液相色谱柱，对中草药及复方的有效成分群进行亲和筛选，通过质谱鉴定有亲和性的化合物成分，再通过体外的抗病毒实验对化合物的活性进行验证，从中药中发现和模板分子具有相同抗流感病毒活性的化合物。本发明专利技术可被借鉴用于筛选鉴定其他活性的化合物，从而缩短药物实体的筛选过程，加快替代药物的研发过程，特别是在非生物学药物筛选方法中具有重要的实际意义和广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了。该方法以流感病毒的特效药物奥司他韦（OS）为模板分子，以丙烯酰胺和4-乙烯基吡啶为功能单体，合成非共价的奥司他韦分子印迹聚合物（OS-MIP），以此为固定相湿法装填液相色谱柱，对中草药及复方的有效成分群进行亲和筛选，通过质谱鉴定有亲和性的化合物成分，再通过体外的抗病毒实验对化合物的活性进行验证，从中药中发现和模板分子具有相同抗流感病毒活性的化合物。本专利技术可被借鉴用于筛选鉴定其他活性的化合物，从而缩短药物实体的筛选过程，加快替代药物的研发过程，特别是在非生物学药物筛选方法中具有重要的实际意义和广阔的应用前景。【专利说明】
本专利技术涉及活性化合物的筛选鉴定方法，特别是涉及一种从中药中分离筛选鉴定与预定模板分子活性相似化合物的非生物学方法。
技术介绍
基于化学合成的新药研发越来越困难，经费投入呈几何级数增加，研发周期也越来越长。因此，越来越多的新技术用于药物的筛选与开发，如组合化学方法:快速生产建立包含成千上万化合物的库；高通量药物筛选技术:采用各种快速高效的筛选检测方法去发现药物前体；基因组学、蛋白组学、代谢组学、ADMETox:将药效学、代谢机理和毒性的研究提前到药物发现这第一环节来进行；虚拟筛选和高内涵筛选技术:基于化学信息学和化学生物学进行药物前体筛选；分子印迹技术:用于中药成分及有关化合物的分离纯化。分子印迹技术(molecularlyimprinting technology, MIT)也称为分子烙印技术，是源于人们对抗体-抗原或酶专一性的认识，合成对模板分子具有特定识别能力的聚合物的技术，是近二十年来出现且发展迅猛的一种高选择性分离技术。由于MIT模仿了生物界的锁匙作用原理，使制备的具有记忆功能的分子印迹聚合物(molecular imprintingpolymers, MIPs)拥有极高的选择性,及很好的物理和化学稳定性,能够抵抗很强的机械作用力，在高温、高压、酸、碱、高浓度离子及有机溶剂等各种恶劣条件下也能保持其原有的特性。在许多相关领域，如手性拆分、固相萃取、膜分离、模拟抗体的免疫分析、人造酶体系、化学或生物传感器、催化剂、组合化学筛分、药物筛选等，得到了越来越广泛的应用。中药作为我国悠久的传统疾病防控药物，许多中药及其复方对病毒性疾病有着良好的预防与治疗作用。但中药及其复方中包含的化合物结构类型多样，是天然的组合化学库，而且各成分含量悬殊，许多成分未知，导致从中分离纯化有效成分费时费力，而且容易丢失微量的有效成分。基于分子识别原理，利用MIPs制成亲和色谱柱，利用色谱分离技术的高速高效性和质谱测定技术的高灵敏度和独有的混合解析能力，在线连接HPLC-MS，理论上可以直接从中药复杂体系中分离、筛选出有效成分并进行直接鉴定。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供。该方法是一种基于分子印迹、液相色谱和质谱联用技术分离筛选鉴定与模板分子活性类似的化合物的非生物学方法，可以从中草药及其复方制剂的有效成分群中，筛选鉴定得到与模板分子活性相似的化合物。本专利技术可以用于从其他成分复杂的体系中，筛选鉴定与已知药物活性类似的化合物。，其步骤包括: a.奥司他韦分子印迹聚合物及其液相色谱柱的制备 以奥司他韦(模板分子)0.1 mmol、功能单体0.69 mmol、乙二醇二甲基丙烯酸酯(交联剂)5 mmol、30%丙烯酰胺和70% 4-乙烯基吡啶作为功能单体、甲苯作为致孔剂、15 mg偶氮二异丁腈作为引发剂，60 °C油浴热引发聚合反应，所得质地坚硬的白色块状聚合物，对其进行研磨筛分，收集粒径在25?45 Mffl之间的颗粒，在索氏提取器中，采用甲醇:乙酸体积比为90: 10对其进行洗脱，以除去模板分子奥司他韦；50°C减压干燥，在2000 psi的压力下，湿法装填150 mmX4.6 mm的液相色谱柱,将该色谱柱接入色谱仪，以合适的流动相对其进行洗脱、平衡，直至出现较为平稳的基线。b.奥司他韦分子印迹液相色谱柱(OSMIP-LC)对OS和其他化合物的亲和分离 色谱条件:Agilent 1200 LC，0S-MIP 自制液相色谱柱(150 mm X 4.6 mm, 25-45Mffl)，柱温30°C;流动相为甲醇-乙腈-甲酸(体积比为75: 25: 0.01)，流速为0.075 ml/min,数据采集软件为MassHunter,压力约170 bar。质谱条件:Agilent 6410A QQQ电喷雾(ESI)串联四级杆质谱仪，喷雾器压力30psi，毛细管电压+4000 V，N2流速10 L/min，温度350 °C，采集周期为200 ms，模式Scan。c.基于奥司他韦分子印迹聚合物与液相色谱、质谱联用，分离筛选鉴定与模板分子活性相似的抗病毒中药有效成分。上述筛选鉴定所得的抗病毒中药与模板分子的母体结构相同，或完全不同 实验表明，制备的奥司他韦非共价分子印迹聚合物，理化性质稳定，重现性好，可以从中草药及其复方制剂的有效成分群中，利用质谱和色谱技术对化合物的成分进行鉴定，发现筛选到亲和性与模板分子相似的化合物苦参碱，以及亲和性更强的化合物为槐定碱。体外抗H9N2亚型禽流感病毒的活性实验结果表明，亲和性与模板分子相似的化合物苦参碱，其具有与模板分子奥司他韦相似的抗H9N2亚型禽流感病毒的活性；而未和性较模板分子更强的化合物槐定碱及其他化合物，在体外则没有抗H9N2亚型禽流感病毒的活性。本专利技术的优点和产生的有益效果是: 我国中草药资源丰富，是天然的化合物库。可以以此活性类似化合物的筛选鉴定方法为依托，合成某些活性化合物的分子印迹聚合物，结合液相色谱和质谱联用技术，从中草药及其复方、甚至微生物的发酵液的化学成分群中，筛选鉴定得到与模板分子活性类似的化合物。特别是对于医学临床中没有备选药物，或者毒副作用较大的药物，以及采用常规生物学筛选方法而危险较大的化合物，可以采用此技术；对于发现新的活性类似的药物实体，可以加快药物筛选的过程。综上所述，本专利技术所涉及的技术将在药物研发领域，具有较大的实际意义和广阔的应用前景。【专利附图】【附图说明】图1 OSMIP-LC对混合物的分离效果；其中a为总离子流图，b为37.7 min时的提取质谱图，c为147.8 min时的提取质谱图。图2连翘苷石油醚提取部分的亲和筛选图谱；其中a为总离子流图，b为31.2 min时的提取质谱图。图3鸭跖草乙酸乙酯提取部分的亲和筛选图谱；其中a为总离子流图，b为34.2min时的提取质谱图。图4炎毒热清氯仿提取部分的亲和筛选图谱；其中a为总离子流图，b为134.5min时的提取质谱图，c为41.3 min时的提取质谱图。图5不同化合物标准品在OSMIP-LC柱上的色谱特性；其中a为苦参碱，b为氧化苦参碱，c为槐定碱，d为氧化槐定碱。图6化合物活性预期保留时间差异的趋势图。【具体实施方式】下面结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。下述实施例中所用方法未特殊说明处，均为常规方法。1.奥司他韦分子印迹聚合物及其液相色谱柱的制备 采用均匀设计法优化聚合物制备过程中的参数，奥司他韦(模板分子)0.1 mmol、功能单体0.69 mmol、乙二醇二甲基丙烯酸酯(交联剂)5 mmol、30%丙烯酰胺和70% 4-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种非生物学筛选抗病毒中药有效成分的方法，其步骤包括：a. 奥司他韦分子印迹聚合物及其液相色谱柱的制备以0.1 mmol奥司他韦为模板分子、0.69 mmol功能单体、5 mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂、30%丙烯酰胺和70% 4‑乙烯基吡啶作为功能单体、甲苯作为致孔剂、15 mg偶氮二异丁腈作为引发剂，60 ℃油浴热引发聚合反应，所得质地坚硬的白色块状聚合物，对其进行研磨筛分，收集粒径在25～45 µm之间的颗粒，在索氏提取器中，采用甲醇‑乙酸，甲醇‑乙酸体积比为90 : 10，对其进行洗脱，以除去模板分子奥司他韦；50 ℃减压干燥，在2000 psi的压力下，湿法装填150 mm × 4.6 mm的液相色谱柱，将该色谱柱接入色谱仪，以合适的流动相对其进行洗脱、平衡，直至出现较为平稳的基线；b. 奥司他韦分子印迹液相色谱柱（OSMIP‑LC）对OS和其他化合物的亲和分离液相色谱条件：Agilent 1200 LC，OS‑MIP自制150 mm × 4.6 mm, 25‑45 µm液相色谱柱，柱温30℃；流动相为甲醇‑乙腈‑甲酸，甲醇 : 乙腈 : 甲酸体积比为75 : 25 : 0.01，流速为0.075 ml/min，数据采集软件为MassHunter，压力约170 bar；质谱条件：Agilent 6410A QQQ电喷雾串联四级杆质谱仪，喷雾器压力30 psi，毛细管电压+4000 V，N2流速10 L/min，温度350 ℃，采集周期为200 ms，模式Scan；c. 基于奥司他韦分子印迹聚合物与液相色谱、质谱联用，分离筛选鉴定与模板分子活性相似的抗病毒中药有效成分。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李剑勇，杨亚军，刘希望，张继瑜，李冰，周绪正，刘玉荣，魏小娟，牛建荣，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62