一种用于生物尿液中四溴双酚A分析的前处理方法技术

一种用于生物尿液中四溴双酚A分析的前处理方法，涉及生物样品中有机污染物的检测分析技术，可为尿液中四溴双酚A含量的测定提供前处理技术。尿液样品经pH值调节后，添加β-葡萄糖苷酸/芳基硫酸脂酶的方式对尿液进行酶解，酶解液通过ENVI-18小柱富集，富集的洗脱液用1％盐酸溶液和二氯甲烷涡旋震荡洗涤，然后用蒸馏水对回收的有机层再次洗涤。样品经超高效液相色谱-串联质谱仪检测表明方法操作简单、回收率高、除杂效果好，适用于生物尿液样品前处理，且特别适用于大批量生物尿液样品的提取净化操作。该发明专利技术可有效分解样品中四溴双酚A的共轭物并有效净化尿液样品，为尿液中四溴双酚A检测提供支持。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】一种用于生物尿液中四溴双酚A分析的前处理方法，涉及生物样品中有机污染物的检测分析技术，可为尿液中四溴双酚A含量的测定提供前处理技术。尿液样品经pH值调节后，添加β-葡萄糖苷酸/芳基硫酸脂酶的方式对尿液进行酶解，酶解液通过ENVI-18小柱富集，富集的洗脱液用1％盐酸溶液和二氯甲烷涡旋震荡洗涤，然后用蒸馏水对回收的有机层再次洗涤。样品经超高效液相色谱-串联质谱仪检测表明方法操作简单、回收率高、除杂效果好，适用于生物尿液样品前处理，且特别适用于大批量生物尿液样品的提取净化操作。该专利技术可有效分解样品中四溴双酚A的共轭物并有效净化尿液样品，为尿液中四溴双酚A检测提供支持。【专利说明】—种用于生物尿液中四溴双酚A分析的前处理方法
本专利技术涉及生物样品中有机污染物的检测分析技术，特别是涉及分析一种生物尿液中四溴双酚A含量的样品提取、净化方法。
技术介绍
近年来，四溴双酚A作为使用量巨大的溴系阻燃剂之一被广泛应用于家用电器和日常用品中，如计算机、打印机、手机、电视机、洗衣机等电子产品以及纺织品、泡沫家具、建筑材料等。根据欧洲溴科学和环境论坛(Brominated Science and Environmental Forum,BSEF)报告，除约旦、以色列、美国、日本等，我国也是四溴双酚A主要生产国。由于相关产品生产规模的不断增长、含四溴双酚A电子废弃物的不断增加，以及可释放到环境中四溴双酚A数量的增加，使得人们开始关注四溴双酚A潜在的环境污染问题和对人体健康的影响。调查显示，由于四溴双酚A使用广泛，世界上很多国家和地区的土壤、沉积物、水体和大气等多种环境介质以及生物样品中均检测到四溴双酚A的赋存，且含量较高。由于频繁在环境介质及生物介质中检测出四溴双酚A，使得公众对四溴双酚A的生物毒性倍加关注。目前研究发现四溴双酚A及其代谢产物在生物体反复暴露的情况下具有潜在的生物蓄积性，及细胞、免疫和内分泌干扰等生物毒性。近年来，四溴双酚A被认为是一种值得探讨和关注的潜在内分泌干扰物，也有研究认为四溴双酚A具有潜在环境持久性和生物累积性，可能引起持久性有机污染问题。欧洲保护东北大西洋海洋环境公约组织(OSPAR)自2001年将四溴双酚A纳入优化控制污染物后至今未将其取消，其报告中认为四溴双酚A具有持久性污染问题。基于此，开展四溴双酚A环境与健康方面的研究具有重要意义，特别是四溴双酚A在生物体介质中的浓度以及通过动物实验模拟四溴双酚A进入生物体后在不同介质中的分布规律对四溴双酚A的影响研究具有重要意义。尿液样品作为非创伤性获取的生物介质，可准确反应生物体经四溴双酚A暴露后的内暴露剂量，可通过监测生物尿液中四溴双酚A含量评价污染物的健康损害，因此尿液样品中四溴双酚A含量的分析技术成为热点。由于尿液样品基质复杂，特别是其中的蛋白等大分子量物质严重影响监测准确度以仪器寿命，尿液中四溴双酚A前处理技术成为四溴双酚A检测的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对生物尿液样品的前处理问题，提供一种操作简单快速、回收率高、除杂效果好、适用于处理批量样品的净化技术，实现对生物尿液样品中四溴双酚A定量分析的技术。本专利技术与现有技术的区别在于，利用酶解法提取尿液样品中四溴双酚A，并用固相萃取小柱与无机溶液洗涤相结合的净化方式，保证了提取效率并避免复杂的净化步骤损失样品中四溴双酚A含量。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下所述。—种适用于分析生物尿液样品中四溴双酚A的前处理方法(图1)，包括以下步骤:(I)准确移取尿液，用稀盐酸调整尿液pH值至5.5，加入pH值为5.5的醋酸钠缓冲液；(2)加入C13标记的四溴双酚A和葡萄糖苷酸/芳基硫酸脂酶，充分混合均匀；(3)置水浴恒温振荡器内恒温避光震荡酶解；(4)酶解后溶液加入少量甲醇混匀，经活化好的ENV1-18小柱富集，用5%甲醇水淋洗，分别用二氯甲烷、甲醇洗脱，并将两次洗脱液混合均匀；(5)洗脱液加入稀盐酸溶液和二氯甲烷后涡旋震荡，置于离心机中低速离心，回收二氯甲烷层；(6) 二氯甲烷层加入蒸馏水涡旋震荡洗涤，置于离心机中低速离心，保留有机层；(7)氮气吹干溶剂后，用甲醇复溶，经0.2 μ m过滤器过滤，过滤后至超高效液相色谱-串联质谱联用仪检测四溴双酚A浓度；另取100 μ L尿液，用酶法测定尿液中肌酐，用肌酐校准，避免尿液样品浓度不同对数据的影响。本方法所述生物包括实验动物、野生动物及人群。本方法所述步骤(3)中尿液中四溴双酚A的提取方法为一次酶解法，酶解温度为370C，酶解时间为4小时，可同时酶解大批量尿液样品。本方法所述尿液四溴双酚A酶解提取方法与超声波清洗仪超声提取相比较具有高回收率特点。长时间超声提取使得提取液温度升高，回收率降低；多次长时间提取，操作繁琐，且耗费大量有机试剂。本专利技术的优点和积极效果是:尿液样品经pH值调节后，采用了添加β_葡萄糖苷酸/芳基硫酸脂酶的方式对尿液进行提取，可以将四溴双酚A-葡糖苷酸共轭物、四溴双酚A-硫酸盐中的四溴双酚A酶解出来，使得尿液中四溴双酚A的测定更精准。酶解液通过ENV1-18小柱富集，富集的洗脱液用I %盐酸溶液和二氯甲烷涡旋震荡洗涤，然后用蒸馏水对回收的有机层再次洗涤后，浓缩并置换为甲醇溶剂，采用超高效液相色谱-串联质谱仪测定，检出限为0.01ng/mL。本方法操作简单、回收率高、除杂效果好，适用于生物尿液样品中四溴双酚A含量的测定，且特别适用于大批量生物尿液样品的同时提取净化操作。本前处理方法的加标回收率如表1所示。表1本前处理方法的加标回收率【权利要求】1.一种用于生物尿液样品中四溴双酚A分析的前处理方法，其特征在于: 该方法包括如下步骤， (1)准确移取尿液，用稀盐酸调整尿液pH值至5.5，加入pH值为5.5的醋酸钠缓冲液； (2)加入C13标记的四溴双酚A和β-葡萄糖苷酸/芳基硫酸脂酶，充分混合均匀； (3)置水浴恒温振荡器内恒温避光震荡酶解； (4)酶解后溶液加入少量甲醇混匀，经活化好的ENV1-18小柱富集，用5%甲醇水淋洗，分别用二氯甲烷、甲醇洗脱，并将两次洗脱液混合均匀； (5)洗脱液加入稀盐酸溶液和二氯甲烷后涡旋震荡，置于离心机中低速离心，回收二氯甲烷层； (6)二氯甲烷层加入蒸馏水涡旋震荡洗涤，置于离心机中低速离心，保留有机层； (7)氮气吹干有机层溶剂后，用甲醇复溶，经0.2 μ m过滤器过滤，过滤后至超高效液相色谱-串联质谱联用仪检测四溴双酚A浓度；另取100μ L尿液，用酶法测定尿液中肌酐，用肌酐校准，避免尿液样品浓度不同对数据的影响。2.如权利I要求所述的前处理方法，其特征在于:该方法所述生物包括实验动物、野生动物及人群。3.如权利I要 求所述的前处理方法，其特征在于:步骤(3)所述尿液中四溴双酚A的提取方法为一次酶解法，酶解温度为37°C，酶解时间为4小时，酶解提取过程不需要有机试剂。【文档编号】G01N30/06GK103901139SQ201410171571【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月28日 优先权日:2014年4月28日 【专利技术者】于云江, 王琼, 孙朋, 向明灯, 张艳平 申请人:中国环境科学研究院本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于生物尿液样品中四溴双酚A分析的前处理方法，其特征在于：该方法包括如下步骤，(1)准确移取尿液，用稀盐酸调整尿液pH值至5.5，加入pH值为5.5的醋酸钠缓冲液；(2)加入C13标记的四溴双酚A和β‑葡萄糖苷酸/芳基硫酸脂酶，充分混合均匀；(3)置水浴恒温振荡器内恒温避光震荡酶解；(4)酶解后溶液加入少量甲醇混匀，经活化好的ENVI‑18小柱富集，用5％甲醇水淋洗，分别用二氯甲烷、甲醇洗脱，并将两次洗脱液混合均匀；(5)洗脱液加入稀盐酸溶液和二氯甲烷后涡旋震荡，置于离心机中低速离心，回收二氯甲烷层；(6)二氯甲烷层加入蒸馏水涡旋震荡洗涤，置于离心机中低速离心，保留有机层；(7)氮气吹干有机层溶剂后，用甲醇复溶，经0.2μm过滤器过滤，过滤后至超高效液相色谱‑串联质谱联用仪检测四溴双酚A浓度；另取100μL尿液，用酶法测定尿液中肌酐，用肌酐校准，避免尿液样品浓度不同对数据的影响。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：于云江，王琼，孙朋，向明灯，张艳平，
申请(专利权)人：中国环境科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11