一种基于酶促异构化反应和连续色谱分离原位耦合的D‑塔格糖生产方法技术

本发明专利技术属于生物和化工领域，特别公开了一种基于酶促异构化反应和色谱分离原位耦合技术，以D‑半乳糖为原料连续生产D‑塔格糖的方法，包括以下步骤：配置缓冲溶液；将嗜热的L‑阿拉伯糖异构酶在水中充分溶解，作为酶溶液；将D‑半乳糖在水中充分溶解，作为原料液；将原料液、缓冲溶液、酶溶液经混合预热后，作为模拟移动床反应器（SMBR）的进料液；进料液进入模拟移动床反应器，经原位反应和分离后，得到D‑塔格糖产品溶液。本发明专利技术确立了SMBR适宜的操作条件，D‑半乳糖转化率达到80%以上，D‑塔格糖纯度达到95%以上，收率超过80%。本发明专利技术公布的方法成本低、污染少、转化率高，且可实现连续生产，有利于保证产品质量的均一性，具有良好的商业化应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于酶促异构化反应和连续色谱分离原位耦合的D-塔格糖生产方法
本专利技术涉及生物化工领域，具体涉及一种基于酶促异构化反应和连续色谱分离原位耦合的D-塔格糖生产方法。
技术介绍
塔格糖是一种六碳酮糖，分子式为C6H12O6，是果糖的差向异构体，也是半乳糖的醛酮同分异构体。塔格糖分子量180g/mol，常态下为白色晶体，熔点和玻璃化温度分别为134℃和15℃，溶于水，微溶于乙醇，酸稳定性良好。D-塔格糖与木糖醇等甜味剂相比，具有口味更好、加工性更强、保健作用更多和安全性更高的特点，是一种优良的食品甜味剂。D-塔格糖2001年被美国食品药物管理局（USFDA）正式批准为普遍公认安全食品(GRAS)，2005年被欧盟批准在欧洲上市。D-塔格糖已在食品、饮料、护齿产品等领域获得了广泛的应用（Krugeretal.,Regul.Toxicol.Pharmacol.,199929(2),pS29-35;Levin,J.Medc.Food,20025(1),p23-26）。D-塔格糖属于稀有糖类，很难直接从自然界中大量获取，只能通过人工手段制备。目前工业化的D-塔格糖生产主要采用化学法，在水溶液中将半乳糖转化成塔格糖，随后经分离步骤进行提纯（Beadleetal.,USPatent,5002612,1991;Fabrice,WOPatent,066192,2005）。化学法的主要问题是使用碱金属盐或碱土金属盐催化剂，副产物众多，给后续的提纯过程造成困难，同时也会造成较为严重的环境污染。D-塔格糖生产的发展趋势是使用生物法，途径主要有两种。一种是利用微生物所产生的脱氢酶将半乳糖醇氧化成塔格糖，Izumori等、Munimzzaman等和Manzoni等分别发现了不同的菌株可以将半乳糖醇氧化成塔格糖（App1.Environ.Microbiol,198446:p1055-1057;ProcessBiochem.,2001,36p971-977;FermentBioeng.,199579p620-622）。然而作为原料的半乳糖醇价格过高，这种方法的商业应用价值并不大。另一种途径则是利用异构酶将低廉的半乳糖异构成塔格糖。Cheetham等利用Lactobacillusgayonii代谢产生的L-阿拉伯糖异构酶成功转化半乳糖生成塔格糖，首次提出利用乳酸菌生产塔格糖的设想（EnzymeMicro.Techno1.,199315p105-108）。张华等人从泡菜中获得高产塔格糖的乳酸菌SKI．002（食品与发酵工业,200632(6):5-7）。翁玮慧等从筛选的乳酸菌中得到L-阿拉伯糖异构酶（食品工业科技,2006(1):158-162）。目前，D-半乳糖异构生成D-塔格糖所需的L-阿拉伯糖异构酶已经得到了较为充分的研究和开发。D-半乳糖异构化生成D-塔格糖为可逆反应，可以表述为：其中A为反应物D-半乳糖，B为异构酶催化剂，C为产物D-塔格糖。转化率、产品溶液纯度和收率的定义为：传统生物法由D-半乳糖制D-塔格糖采用以下工艺流程：D-半乳糖——超滤——反渗透——微滤——水解——浓缩——发酵——异构化——浓缩——结晶——D-塔格糖成品这一流程未能实现工业化的主要制约因素有两点：一是从工艺水平上看，D-半乳糖的转化率较低。以往技术主要从酶的菌株来源方面着手，试图提高转化率。然而，可逆反应转化率受化学平衡限制。理论上，任何催化剂（酶）都不能打破这一限制。因此，该方法的转化率往往被局限在40%左右。二是从生产方式上看，生物法采用传统的批次操作。随着可逆反应中产物的不断积累，酶的活性逐渐降低，逆反应影响越来越大，造成反应周期漫长（通常为2-3天）、生产效率低下的问题，同时也难以保证不同反应周期所得产品质量的均一性。为提高D-半乳糖的转化率，中国专利技术专利200780045683.0通过添加硼酸盐与产物D-塔格糖结合，使化学平衡向右移动，将D-半乳糖转化率提高到70%的水平。然而该方法仍存在几个问题。一是硼酸盐有毒，不适合用于食品添加剂生产；二是添加硼酸盐后增加了下游分离纯化单元的负担；三是采用批次釜式反应器进行，反应周期仍在20小时以上，转化率无法进一步提高。近年来，模拟移动床色谱技术开始被应用与D-塔格糖的生产过程。如中国专利技术专利201080017863.X中涉及到从复杂糖类混合物中提取塔格糖，该生产过程是一个纯粹的分离过程，不涉及到反应。中国专利技术专利201210329027.6中涉及到采用模拟移动床分离塔格糖和半乳糖。但在该过程中，模拟移动床与批次釜式反应器为串联关系，模拟移动床起到的仍然是纯粹的分离作用，即将产物D-塔格糖和未反应的原料糖或其他副产物分开。因为反应仍在批次釜式反应器中进行，该种分离无法改变化学平衡，也不能被用来提高D-半乳糖到D-塔格糖的转化率，D-塔格糖的收率仅为40%。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种以D-半乳糖到D-塔格糖的高效转化方法，采用模拟移动床反应器，结合适宜的操作条件，使酶促异构化反应和连续色谱分离原位耦合；模拟移动床作为酶促异构化反应进行的原位场所，把产物与反应物即时分开，从而克服平衡转化率和产物反馈抑制作用的影响，在不使用毒性添加剂的前提下，达到提高D-半乳糖转化率的目的，同时直接得到高纯度的D-塔格糖产品。令人惊喜的是，采用本专利技术的方法，可以从D-半乳糖直接制得纯度超过95%的D-塔格糖，同时使得D-半乳糖的转化率以及D-塔格糖的收率达到80%以上，并可将D-半乳糖的转化率以及D-塔格糖的收率进一步提高到95%。为此，本专利技术采用的技术方案如下：一种基于酶促异构化反应和色谱分离原位耦合，以D-半乳糖为原料连续生产D-塔格糖的方法，包括以下步骤：(1)配置pH值6～7.4的缓冲溶液；(2)将嗜热的L-阿拉伯糖异构酶在部分缓冲溶液中充分溶解，作为酶溶液；(3)将D-半乳糖在水中充分溶解，作为原料液；(4)将步骤(1)、(2)、(3)中分别得到的缓冲溶液、酶溶液和原料液经混合预热后，作为进料液，所述的进料液中不含目标产物D-塔格糖；(5)将步骤(4)中得到的进料液进入模拟移动床反应器，经原位反应和分离后，直接得到D-塔格糖产品溶液。作为优选，所述步骤(1)中所配置的缓冲溶液每升中含有氯化钠8～8.5g、磷酸氢钠30～50g和磷酸二氢钠0.2～0.5g，调节pH值至6～7.4；作为优选，所述步骤(2)中L-阿拉伯糖异构酶为从大肠杆菌K12基因组中通过克隆方法表达阿拉伯糖异构酶制得的粗酶液；作为优选，所述步骤(4)中所配进料液中D-半乳糖浓度为10～150g/l，酶活力单位为0.1～0.28U/ml，pH值为6～7.4；作为优选，所述步骤(4)中混合预热过程在缓冲罐中进行；作为优选，所述步骤(4)中混合预热温度为60～80℃；作为优选，所述步骤(5)中的模拟移动床反应器为四区模拟移动床反应器，每区由1～6根色谱柱组成；作为优选，所述步骤(5)中模拟移动床反应器中的色谱柱填料为SugarSP0810；作为优选，所述步骤(5)中模拟移动床反应器为等温操作，柱温60～80℃；步骤(5)中四区模拟移动床反应器的操作条件为：切换时间60～80min，I区流率1.35～1.4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于酶促异构化反应和连续色谱分离原位耦合的D‑塔格糖生产方法，包括以下步骤：(1) 配置pH值6～7.4的缓冲溶液；(2) 将嗜热的L‑阿拉伯糖异构酶在部分缓冲溶液中充分溶解，作为酶溶液；(3) 将D‑半乳糖在水中充分溶解，作为原料液；(4) 将步骤(1)、(2)、(3)中分别得到的缓冲溶液、酶溶液和原料液经混合预热后，作为进料液，所述的进料液中不含目标产物D‑塔格糖；(5) 将步骤(4)中得到的进料液进入模拟移动床反应器，经原位反应和分离后，直接得到D‑塔格糖产品溶液。

【技术特征摘要】
1.一种基于酶促异构化反应和连续色谱分离原位耦合的D-塔格糖生产方法，包括以下步骤：(1)配置pH值6～7.4的缓冲溶液；(2)将嗜热的L-阿拉伯糖异构酶在部分缓冲溶液中充分溶解，作为酶溶液；(3)将D-半乳糖在水中充分溶解，作为原料液；(4)将步骤(1)、(2)、(3)中分别得到的缓冲溶液、酶溶液和原料液经混合预热后，作为进料液，所述的进料液中不含目标产物D-塔格糖；(5)将步骤(4)中得到的进料液进入模拟移动床反应器，经原位反应和分离后，直接得到D-塔格糖产品溶液；所述模拟移动床反应器为等温操作，柱温60～80℃；所述模拟移动床反应器为四区模拟移动床反应器，每区由1～6根色谱柱组成；所述四区模拟移动床反应器的操作条件为：切换时间60～80min，I区流率1.35～1.4，II区流率0.4～0.8，III区流率0.6～0.93，IV区流率≤0.4。2.根据权利要求1所述的D-塔格糖生...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐进，余卫芳，周慧君，
申请(专利权)人：温州大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33