本发明专利技术公开了一种重组蛋白IE1包被酶标反应板的制备方法及定量检测人血浆HCMV中和抗体试剂盒，涉及一种新的重组抗原IE1包被酶标反应板的制法，以及在其基础上制备ELISA定量检测人血浆HCMV中和抗体试剂盒。所述方法包括用基因工程方法制备特异性重组HCMVIE1抗原、蛋白纯化、酶标反应板包被以及定量检测人血浆HCMV中和抗体ELISA试剂盒的组装。与其它市售ELISA试剂盒相比，本发明专利技术能够高度特异、敏感、快速地检测血浆中具有中和作用的HCMV特异性IgG抗体滴度，检测的结果与微量中和试验的结果高度一致。本发明专利技术主要供实验室研究、临床筛查和血制品企业筛选高滴度HCMV静脉注射丙种球蛋白生产原料使用。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种重组蛋白IE1包被酶标反应板的制备方法及定量检测人血浆HCMV中和抗体试剂盒，涉及一种新的重组抗原IE1包被酶标反应板的制法，以及在其基础上制备ELISA定量检测人血浆HCMV中和抗体试剂盒。所述方法包括用基因工程方法制备特异性重组HCMVIE1抗原、蛋白纯化、酶标反应板包被以及定量检测人血浆HCMV中和抗体ELISA试剂盒的组装。与其它市售ELISA试剂盒相比，本专利技术能够高度特异、敏感、快速地检测血浆中具有中和作用的HCMV特异性IgG抗体滴度，检测的结果与微量中和试验的结果高度一致。本专利技术主要供实验室研究、临床筛查和血制品企业筛选高滴度HCMV静脉注射丙种球蛋白生产原料使用。【专利说明】一种重组蛋白IE1包被酶标反应板的制备方法及定量检测人血浆HCMV中和抗体试剂盒
本专利技术涉及基因工程技术、诊断试剂和血液制品研发领域，特别是涉及一种重组蛋白IEl包被酶标反应板的制备方法及定量检测人血浆HCMV中和抗体试剂盒。
技术介绍
人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)属于人类疱疫病毒β亚科病毒，在人群中的感染极为普遍，呈世界性分布，血清流行病学调查表明，40?100%成人有HCMV抗体。目前的研究表明HCMV是人类先天性感染最常见的病原体之一，对孕妇及胎儿影响巨大，常造成流产、死胎、胎儿畸形、发育迟缓及迟发性中枢神经系统缺陷等疾病。孕妇在孕期(尤其是妊娠早期)因激素水平的急剧变化、心理和免疫水平等改变，使原发性感染机会增加，激活潜伏的HCMV、或感染新的HCMV毒株产生再发感染，病毒经胎盘传给胎儿，引起胎儿先天性感染。先天性HCMV感染是引起出生缺陷最常见和最重要的病毒病因，主要表现为神经损伤如引起小脑畸形、室周钙化、脑水肿、小眼畸形等。非遗传性感音神经听觉丧失(sensorineural hearing loss, SNHL)是先天性HCMV感染最常见的后遗症表现。研究发现，发达国家先天性HCMV感染率比发展中国家低，如意大利为0.47%(Cl:0.22 - 1.0%);瑞典为 0.46%(Cl:0.37 - 0.58%);而冈比亚则高达 13.6%。在美国，每年约有40000新生儿发生先天性HCMV感染，其中10%?15%发生迟发性后遗症，主要为SNHL、智力障碍、学习能力低下等神经系统损伤性疾病，其中因SNHL每年付出高达10亿美元的医疗帐单。2011年，我国出生人口约1615万，按照发达国家先天性HCMV感染率来计算，我国每年约有16.2万例先天性HCMV感染，家庭和国家都将为此支出高昂的成本。根据目前的临床资料显示，实际上先天性HCMV感染的人数可能是16.2万人/年的2?3倍。此夕卜，HCMV感染也是器官移植失败和艾滋病病人并发感染死亡的主要原因之一。鉴于HCMV对人类的巨大危害，人们一直在寻找更好的治疗方法。最常用的抗病毒药物为更昔洛韦，但是由于长期使用目前已经出现了很多耐药毒株，尤其是在移植患者和艾滋病患者中更为常见。具有高中和滴度的特异性HCMV IgG已被证明具有良好的治疗作用，而且不产生耐药性。因此，筛选含高HCMV中和滴度的血浆，制备静脉丙种球蛋白制剂，将有助于对HCMV感染的治疗。HCMV虽然在人群中的感染率很高，HCMV特异性IgG的含量也不低，但是体外病毒中和实验证明只有约5%的高滴度血浆才具中和病毒的能力。目前虽有部分用于检测人血浆中HCMV IgG滴度的ELISA试剂盒，但其结果与病毒中和实验的结果不一致。因此，用这些试剂盒筛选的高滴度血浆并不能用于特异性静脉丙种球蛋白制剂生产。这与ELISA试剂盒选用的包被抗原有关，HCMV感染机体主要由ppl50蛋白诱导机体产生体液免疫，因此市售的ELISA试剂盒多采用ppl50蛋白作为包被抗原，但针对ppl50蛋白的抗原并不具有中和病毒的能力。IEl基因是HCMV的立即早期基因，控制病毒DNA的复制，它在病毒感染2h即开始表达，体外实验显示IEl的单克隆抗体可以阻断HCMV感染易感细胞。鉴于此，我们选取了编码IEl基因的部分序列基因(1006?1521nt)，采用基因重组技术，原核表达，亲和层析后获得一种融合IEl重组蛋白。经过改造过的IEl重组蛋白既保留了其抗原性，又提高原核表达量。采用该重组蛋白包被ELISA板，我们成功地用间接ELISA法，快速筛查出中和抗体含量更高的人血浆，其结果与中和实验结果一致率大于96.0%
技术实现思路
本专利技术目的就是为了弥补已有技术的缺陷，提供一种重组蛋白IEl包被酶标反应板的制备方法及定量检测人血浆HCMV中和抗体试剂盒。本专利技术是通过以下技术方案实现的:一种重组蛋白IEl包被酶标反应板的制备方法，包括以下步骤:(1)将IEl蛋白抗原用pH为9-10的碳酸盐缓冲液稀释后包被96孔板，IOOng/孔，置湿盒中4°C，22-24小时，PBST洗板3次，每次2_4min，然后拍干；(2)每孔加入100 μ I含1%BSA和10%小牛血清的PBS，37°C孵育lh，洗板3次后密封，即得所述的重组蛋白IEl包被酶标反应板。一种重组蛋白IEl包被酶标反应板的制备方法，所述的重组蛋白IEl的氨基酸残基序列如SEQ N0.1所示。一种重组蛋白IEl包被酶标反应板的制备方法，所述的重组蛋白IEl的DNA核苷酸序列如SEQ N0.2所示。一种ELISA定量检测人血浆HCMV中和抗体试剂盒，所述的试剂盒使用的酶标反应板为权利要求1所述的重组蛋白IEl包被酶标反应板。本专利技术中所述的IEl重组蛋白的氨基酸序列(SEQ N0.1):【权利要求】1.一种重组蛋白IEl包被酶标反应板的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)将IEl蛋白抗原用pH为9-10的碳酸盐缓冲液稀释后包被96孔板，1OOng/孔，置湿盒中4°C，22-24小时，PBST洗板3次，每次2_4min，然后拍干； (2)每孔加入100μ 1含1% BSA和10%小牛血清的PBS，37°C孵育Ih，洗板3次后密封，即得所述的重组蛋白IEl包被酶标反应板。2.根据权利要求1所述的一种重组蛋白IEl包被酶标反应板的制备方法，其特征在于，所述的重组蛋白IEl的氨基酸残基序列如SEQ N0.1所示。3.根据权利要求1所述的一种重组蛋白IEl包被酶标反应板的制备方法，其特征在于，所述的重组蛋白IEl的DNA核苷酸序列如SEQ N0.2所示。4.一种ELISA定量检测人血浆HCMV中和抗体试剂盒，其特征在于所述的试剂盒使用的酶标反应板为权利要求1所述的重组蛋白IEl包被酶标反应板。【文档编号】G01N33/68GK103901209SQ201410056988【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年2月18日 优先权日:2014年2月18日 【专利技术者】王明丽, 甘霖 申请人:王明丽, 甘霖本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组蛋白IE1包被酶标反应板的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）将IE1蛋白抗原用pH为9‑10的碳酸盐缓冲液稀释后包被96孔板，100ng/孔，置湿盒中4℃，22‑24小时，PBST洗板3次，每次2‑4min，然后拍干； （2）每孔加入100 μl含1% BSA和10%小牛血清的PBS，37℃孵育1h ，洗板3次后密封，即得所述的重组蛋白IE1包被酶标反应板。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王明丽，甘霖，
申请(专利权)人：王明丽，甘霖，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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