本申请提供了用于检测源自重组植物的生物学样品中aad-12基因事件的材料和方法及用于检测源自重组植物的样品中污染性事件的材料和方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本申请提供了用于检测源自重组植物的生物学样品中aad-12基因事件的材料和方法及用于检测源自重组植物的样品中污染性事件的材料和方法。【专利说明】用于检测植物中的芳氧基链烷酸酯加双氧酶基因(AAD-12)的材料和方法对相关申请的交叉引用本申请要求2011年10月18日提交的美国临时申请流水号61/548，543的权益。专利技术背景大豆是一种重要的作物，并且是世界上许多地区的主要食物来源。生物技术方法已经应用于大豆以改善产品的农艺学性状和质量。对大豆植物引入的农艺学性状的例子包括除草剂抗性和昆虫抗性。aad-12基因(最初来自食酸戴尔福特菌(Delftia acidovorans))编码芳氧基链烧酸酯加双氧酶(aryloxyalkanoate dioxygenase, AAD-12)蛋白。此基因赋予对例如2，4-二氯苯氧基乙酸及对吡唳基氧基乙酸酯(pyridyloxyacetate)除草剂的耐受性。用于在植物中引入除草剂耐受性的aad-12基因自身在WO 2007/053482中披露。异源或外来基因(转基因)在植物中的表达受到外来基因在何处插入染色体中影响。例如，这可以是由于染色质结构(例如，异染色质)或转录调节元件(例如，增强子)接近整合位点的接近性(Weising等，Ann.Rev.Genet 22:421-477，1988)所致。因此,相同类型的转基因植物(或其它生物体)中的相同基因可以在不同事件间展现出表达水平的广泛变化。还可能存在着空间或时间表达样式的差异。例如，转基因在各个植物组织中的相对表达差异可以不对应于自存在于导入植物中的基因构建体中的转录调节元件预期的样式。如此，经常创建大量事件，并进行筛选以鉴定以对于给定的目的满意的水平表达导入的感兴趣基因的事件。对于商业目的，生成成百上千个不同事件，并对那些事件筛选具有期望的转基因表达水平和样式的单一事件是常见的。具有期望的转基因表达水平和/或样式的事件可用于使用常规的育种方法通过有性异型杂交(outcrossing)将转基因基因渗入(introgress)其它遗传背景中。此类杂交的后代维持初始转化体的转基因表达特征。使用此策略来确保充分适应于地方生长条件的许多品种(variety)中的可靠基因表达。会有利的是，能够检测特定植物的转基因和/或基因组DNA的存在以测定有性杂交的后代是否含有感兴趣的转基因和/或基因组DNA。另外，在遵守要求源自重组作物植物的食物的上市前批准和加标记的规定时，用于检测特定植物中的转基因和/或基因组DNA的存在的方法会是有用的。有可能通过任何公知的核酸检测方法检测转基因的存在。例子包括聚合酶链式反应(PCR)或使用核酸探针的DNA杂交。这些检测方法一般聚焦于常用的遗传元件，诸如启动子、终止子、标志物基因、或其它常用的遗传元件。此类方法不可用于区分不同事件，特别是那些使用相同DNA构建体生成的事件，除非与插入DNA相邻的染色体DNA序列(“侧翼DNA”)是已知的。出于育种、性状渐渗、和种子纯度目的，能够测定植物中转基因事件的接合性也是重要的。出于管理和种子质量原因，能够快速检测大豆植物材料中的混合aad-12基因事件(有意或无意)的存在也是有利的。 专利技术概述本专利技术涉及生物学样品中的aad-12基因事件检测。本专利技术提供了鉴定遗传工程化植物的方法,所述遗传工程化植物具有含有一个或多个aad-12事件的基因组DNA (gDNA)。本专利中描述的测定法是aad-12基因特异性的，非事件特异性的，并且检测且任选地测定任何aad-12基因事件的接合性。本专利技术能够经由转基因拷贝数分析相对于特定aad-12测定无意aad_12事件的污染。如此，本专利技术的一个方面提供了用于测定生物学样品(例如来自大豆)中的aad-12转基因的存在的测定法。测定法可以基于插入大豆基因组中的重组构建体的DNA序列。还提供了可用于进行测定法的试剂盒和条件。本专利技术还涉及可用于克隆和分析aad-12基因相关DNA序列的核酸序列。本专利技术的此方面的某些实施方案提供了用于检测aad-12的基因特异性引物及用这些基因特异性引物组生成的PCR扩增子。因此，这些和其它相关方法可以用于鉴定含有aad-12基因的植物。附图简述图1:aad-12事件416的基因特异性测定法。黑色上部点分组代表来自在aad_12方面纯合的大豆样品的荧光读出。中间更亮的点分组代表来自在aad-12方面半合子的大豆样品的荧光读出。更低的点分组代表来自在aad-12事件方面呈阴性的野生型大豆样品的荧光读出。图2:aad_12事件4406的基因特异性测定法。黑色上部点分组代表来自在aad_12方面纯合的大豆样品的荧光读出。中间更亮的点分组代表来自在aad-12方面半合子的大豆样品的荧光读出。更低的点分组代表来自在aad-12事件方面呈阴性的野生型大豆样品的荧光读出。专利技术详述`转基因导入和整合植物基因组涉及随机事件(因此对于表达的给定插入使用名称“事件”)，并且对于多种转化技术如土壤杆菌转化，“基因枪(genegun) ”转化和WHISKERS，无法预测转基因会在何处插入植物基因组中。在美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection(ATCC),10801University Boulevard, Manassas, VA, 20110)保藏了包含一个所述 aad-12 基因事件PDAB4472-1606的大豆系的至少2500个种子，并使公众可以不受限制的获得(但专利权适用)。该保藏命名为ATCC保藏号PTA-11028，具有保藏日2010年6月10日。该保藏是，并会维持是为了专利程序的目的依照布达佩斯条约进行的，并受其涉及种子保藏的条款约束。该保藏会不设限地保持在ATCC保藏机构(其为公开保藏机构)至下述之中最晚者:30年，或最后一次要求之后五年，或本专利的有效期限，并在此期间，若其不具生活力，则会加以替换。本文中提供了定义和实例以帮助描述本专利技术并指导本领域一般技术人员实施本专利技术。除非另外指明，应根据相关领域的一般技术人员的常规用法来理解术语。“生物学样品”可以包含源自大豆细胞或组织，包括茎、根、叶、花或花部分、种子或种子荚等的任何有机材料，其含有与此类有机材料对应的可检测量的核苷酸序列。“探针”是一种分离的核酸，其附接有常规的可检测标记物或报告物分子(例如放射性同位素、荧光团、配体、化学发光剂、或酶)。此类探针与靶核酸的链，在本专利技术的情况中，与编码aad-12基因的重组DNA的链互补。依照本专利技术的探针不仅包含脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且还包含特异性结合靶DNA序列的聚酰胺和其它探针材料，并且此类结合可以用于检测所述靶DNA序列的存在。“引物”是通过核酸杂交与互补靶DNA链退火以形成引物与靶DNA链间的杂合物，然后通过聚合酶，例如DNA聚合酶(例如DNA聚合酶)沿着靶DNA链延伸的分离的核酸。本专利技术的引物对指其用于扩增靶核酸序列的用途，例如通过聚合酶链式反应(PCR)或其它常规的核酸扩增方法来实现。探针和引物的长度一般是11至30个核苷酸或更多。在某些例子中，探针和引物可以具有超过30个核苷酸的长度。不管大小如何，探针和引物可以在高严格性杂交条件下与本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的引物或探针，其包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：CA钱纳巴萨瓦拉德亚，A格里恩瓦尔德，
申请(专利权)人：陶氏益农公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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