本发明专利技术提出了一种底物亲和力强、催化效率高的AusMan5A-TviCBM融合酶的设计与构建的方法，其核苷酸序列为SEQ?ID?NO：1，氨基酸序列为SEQ?ID?NO：2，相应的基因命名为man5A-cbm。本发明专利技术还公开了融合酶工程菌的构建以及高效表达和纯化的方法，制备的融合酶具有底物亲和力强、催化效率高的特性，具有较大的工业化生产潜力和经济价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程和蛋白质表达领域，尤其涉及AusMan5A-TviCBM融合酶基因的构建和表达，以及该酶的性质和应用的研究。
技术介绍
β -甘露聚糖酶(β -l，4-D-mannan mannohydrolase, EC 3. 2. 1. 78)是一种能从均一甘露聚糖和异甘露聚糖主链的内部降解β-1，4-甘露糖苷键的水解酶，属于半纤维素酶类，其广泛地存在于微生物、植物和动物中。它可以广泛应用于食品、医药、饲料、造纸、印染和石油工业等领域。在食品和医药领域，β-甘露聚糖酶作用于甘露聚糖后可以产生功能性低聚糖，这种低聚糖可以有效地降低人体血糖和胆固醇水平且有利于人和动物肠道内益生菌群的生长，进而调节人和动物的免疫系统、提高免疫力。在饲料工业中，它作为饲料添加剂能有效降解植物细胞壁中的甘露聚糖成分，消除抗营养因子，提高能量利用率、改善饲料转化率。在造纸工业中，甘露聚糖酶和木聚糖酶等半纤维素降解酶类协同使用， 处理纸浆，能明显改善纸质。将甘露聚糖酶运用纺织印染的漂白工艺中，能有效地去除产品上粘附的多余染料，更可以减少氯和碱的用量以及它们带来的环境污染问题，有利于生态环境的保护。目前已报道的能产甘露聚糖酶的微生物主要来自于细菌、真菌和放线菌，例如细菌中的枯草芽孢杆菌，真菌中的曲霉、木霉、青霉、酵母，以及放线菌中的链霉菌等。目前，关于第5家族β -甘露聚糖酶的报道较多，它们的最适ρΗ值为3. 0 7. 5，最适温度在45 92°C。近年来，随着对自然界中半纤维素资源的开发、饲粮中甘露聚糖抗营养因子的消除以及甘露寡糖生理功能的发现，β-甘露聚糖酶的需求量越来越大，导致对β-甘露聚糖酶的研究和开发进入一个新高潮。但就国内外相关文献或专利报道来看，微生物甘露聚糖酶发酵酶活性普遍不高，导致了生产成本很高，从而阻碍了该酶在众多领域中的广泛应用。为了提高甘露聚糖酶的发酵产率和酶活性，早期的研究工作主要集中在产酶菌种的筛选、诱变、产酶诱导，酶的分离纯化及性质，酶水解底物方式及应用等方面。进入90 年代，随着基因工程技术和蛋白质工程技术的广泛应用，研究工作逐步转向酶基因的克隆和表达以及酶活性位点的研究等方面。目前，虽已有一些有关甘露聚糖酶基因的克隆和表达的文献和专利报道，但有关基于理性设计的甘露聚糖酶的分子改造，尤其是关于嵌合酶基因设计和表达的研究未见有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种底物亲和力强、催化效率高的AuSMan5A-TviCBM融合酶的设计与构建的方法，对原有的宇佐美曲霉Man5A进行了分子改造。本专利技术的技术方案将原有的宇佐美曲霉Man5A与T. viride WL 0422的β -甘露聚糖酶的碳水化合物结合结构域(CBM)融合，构建出AuSMan5A-TviCBM融合酶，融合酶的核苷酸序列为SEQ ID NO :1，相应地基因命名为man5A-cbm。携带有宇佐美曲霉Aus Man5A基因的重组质粒pUCm-T-man5A有由江南大学构建和保藏(专利申请号:201010550927. 4)。T. viride WL 0422菌株由江南大学筛选和保藏，该菌株已于2006年在《江苏食品与发酵》杂志的No. 1 Pg. 1公开，本专利技术人承诺该菌株在20年内向公众发放。所述的嵌合酶的氨基酸序列为SEQ ID NO :2。所述的嵌合酶的活性测定方法于25mL具塞试管A和B中，各加入用pH 4. 8、乙酸-乙酸钠缓冲液配制的质量浓度为0. 5%的角豆胶溶液2. 4mL，50°C预热lOmin，在A管中加入0. ImL适当稀释的酶液，50°C 准确反应IOmin ；立即各加入2. 5mL 3'，5' - 二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加 0. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ；冷却后各加去离子水5mL，摇勻；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从甘露糖标准曲线上查出相应的还原糖(以甘露糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义在本测定条件下，以每分钟产生1 μ mol还原糖所需的酶量定义为1个β -甘露聚糖酶活性单位(IU)。所述的嵌合酶基因的构建和表达的方法(I)CBM 数据库的建立根据 Carbohydrate-Active enZYmes Database (http // www. cazy. org/)中收录的信息，选取CBMl (主要是纤维素结合结构域)成员建立一个CBM 数据库，并收录与Km值有关地文献。(2) CBM与底物的对接和分子动力学模拟选取有代表性的几个CBM分别与底物用 AutoDock4. 2软进行分子对接，然后用GR0MACS进行分子动力学模拟，最终选取绿色木霉甘露聚糖酶的CBM融合到Aus Man5A的羧基端。(3)嵌合酶Aus Man5A-CBM基因的合成基于上面设计的嵌合酶基因序列，采用重叠PCR技术将Aus Man5A的基因序列与CBM的核苷酸序列融合。重叠PCR涉及到的两对引物分别为AMan5A-F GAATTCTCCTTCGCCAGCACCTC,待融合的宇佐美曲霉 Aus Man5A 的基因片段的上游引物；AMan5A-R TTGTACCGCCGGCACTATCAATAGCAGCAA,待融合的宇佐美曲霉 Aus Man5A 的基因片段的下游引物；Tman5A-Fl TGATAGTGCCGGCGGTACAACCACTCC,待融合的 CBM 基因片段的上游引物；Tman5A-R GCGGCCGCTCATGTATTCAGGCATTGCG,待融合的 CBM 基因片段的下游引物；先分别PCR合成待融合的上下游片段，PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析并割胶回收目的条带。然后各取2ul上下游片段互为引物和模板进行嵌合酶基因的初步合成，最后加入AMan5A-F和Tman5A-R引物进行嵌合酶基因的大量扩增。将PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-man5A-cbm)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。将测序结果正确的pUCm-T-man5A-cbm与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I 进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒 pPIC9K-man5A-cbm(图1)，并对重组质粒进行序列测定。(4)GS115/man5A-cbm的构建、表达、产物纯化及活性测定用Sal I对 pPIC9K-man5A-cbm进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/man5A-cbm ；按照手册上的标准流程进行诱导表达，用DNS法测定嵌合酶的甘露聚糖酶活性；发酵液经冷冻离心、超滤、离子交换层析和凝胶过滤层析，得到电泳纯的嵌合酶。(5)嵌合酶动力学常数的测定分别取不同浓度的角豆胶(1 10mg/mL)按照酶活测定的条件测定水解反应速率，然后用双倒数作图的方法算出Kn^PVmaxtj本专利技术的有益效果本专利技术提供了一种宇佐美曲霉Aus Man5A-CBM嵌合酶的设计与构建的方法，新型嵌合酶工程菌GS115/man5A-cbm的构建，以其嵌合酶的高效表达和纯化的方法。嵌合酶具有底物亲和力强、催化效率高的优点，有较大的工业化本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邬敏辰，唐存多，李剑芳，陈忠法，赵顺阁，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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