一种具抗凝活性的菲牛蛭素多肽及其制备方法与用途技术

本发明专利技术涉及生物领域，公开了一种具有抗凝活性的菲牛蛭素多肽及含该多肽的临床制剂。本发明专利技术所述菲牛蛭素多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术还提供所述菲牛蛭素活性肽的制备方法与用途。

【技术实现步骤摘要】
一种具抗凝活性的菲牛蛭素多肽及其制备方法与用途
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种具抗凝活性的菲牛蛭素多肽及其制备方法与用途。
技术介绍
水蛭素（hirudin）是由60多个氨基酸组成的小分子量蛋白质，相对分子量为7kDa左右，是迄今为止发现的最强的凝血酶特异性抑制剂。天然水蛭素最早是从欧洲医蛭唾液腺中分离出来的，至少有20多种突变体，其中由全身提取的水蛭素称为HV1，由头部提取的水蛭素称为HV2，二者氨基酸序列同源性为86%。天然水蛭素的N端由疏水性氨基酸组成，3个二硫键组成稳定的构象。C端富含带负电荷的酸性氨基酸残基，可与凝血酶的正电荷部位结合，以静电作用阻止凝血酶与纤维蛋白原的识别位点结合。中间部位的Pro46-Lys47-Pro48与凝血酶的Arg环结合，是水蛭素与凝血酶结合的催化位点。此外，63位Try残基的硫酸化提高了它与凝血酶的结合能力，增强了水蛭素抗凝血作用的特异性。由于医蛭食性较杂，人们逐渐把注意力转向以哺乳动物为主要吸血对象的东南亚菲牛蛭（Hirudinariamanillensis），希望获得更适合人类的抗凝血物质。1992年Steiner等首次从产自马尼拉的菲牛蛭中提取了2种水蛭素。1993年Scacheri等从菲牛蛭中分离出了2种水蛭素变异体（菲牛蛭素HM1和HM2），并测定其氨基酸序列，cDNA克隆和表达，表达产物有抗凝活性。菲牛蛭素（HM1及HM2）的活性与医蛭来源的水蛭素（HV1及HV2）相似，但是二者同源性低于60%，且前者不存在硫酸化位点。由于水蛭来源有限，从医蛭中提取天然水蛭素满足不了临床的大量需求，继续寻求大量合成具有抗凝活性的多肽的解决方案。
技术实现思路
本专利技术以我国广西菲牛蛭为原材料，通过基因重组的方法扩增菲牛蛭素基因片段，并在大肠杆菌表达系统中进行活性表达，采用中国药典的凝血酶滴定法测定本专利技术所述菲牛蛭素活性肽的抗凝血活性，活性高达20080ATU/g。本专利技术提供的菲牛蛭素活性肽，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术还提供编码所述菲牛蛭素活性肽的基因。优选地，所述基因核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。本专利技术的另一个目的是提供所述菲牛蛭素活性肽的制备方法。在具体实施方式中，本专利技术所述的制备方法包含以下步骤：步骤1：以编码所述菲牛蛭素活性肽的cDNA为模板，设计引物进行PCR扩增，上游引物如SEQIDNo.3所示，下游引物如SEQIDNo.4所示；步骤2：对扩增产物与质粒进行重组构建原核表达载体；将所得原核表达载体转入宿主细胞E.coliBL21（DE3）进行蛋白表达；步骤3：收集菌体，离心弃沉淀，收上清；向上清中加硫酸铵达硫酸铵饱和度，静置后离心弃上清，取沉淀用pH7.4PBS溶解；步骤4：将步骤3所得溶解液超滤除杂，用0.1MNaCl溶液洗膜，收集穿过液；穿过液用G-25柱脱盐，收集层析图谱中第一个吸收峰，即得。所述模板核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。所述PCR扩增反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃60s，72℃45s，30次；72℃10min。作为优选，所述质粒为Pet22b。更优选地，步骤2所述蛋白表达经IPTG诱导。作为优选，所述超滤为用0.45μm醋酸纤维滤膜过滤后，用30kDa超滤管，于4℃、4000rpm超滤。在本专利技术的具体实施方式中，是将溶解上清液用13000g离心10min，收上清，用0.45μμm醋酸纤维滤膜过滤上清；后用30kDaMilliPore超滤管，于4℃，4000rpm超滤。本专利技术还提供所述菲牛蛭素活性肽在制备抗凝药物中的用途。本专利技术还提供临床制剂，包括所述的菲牛蛭素活性肽及药学上可接受的辅料。所述的临床制剂包括口服制剂或注射制剂，口服制剂优选为胶囊剂或片剂、颗粒剂；注射制剂优选为注射液或冻干粉针剂。专利技术人经过大量实验发现，含有pET22b质粒的大肠杆菌的对照组诱导后的培养基组分和破碎细胞的上清液没有或者几乎没有活性。而含有4种异构体的重组大肠杆菌的培养基组分和破碎细胞的上清液均表现出不同程度的抗凝血活性，4种异构体的氨基酸序列，两两比较仅有一个氨基酸序列存在差异。含有pET22b-HMb-1重组质粒的重组大肠杆菌诱导后的培养基组分呈现出最高的抗凝血活性，为300ATU/mL。而采用中国药典的凝血酶滴定法对该培养基组分中的菲牛蛭素活性肽（I峰）的抗凝血活性进行测定，活性高达20080ATU/g，较之天然菲牛蛭素干粉活性1300ATU/g。动物实验显示，白兔灌胃给予本专利技术所述菲牛蛭素活性肽FNZ后，于给药前及给药后不同时间点采血，观察FNZ的抗凝效应。结果表明，口服4mg/kg剂量本专利技术所述菲牛蛭素活性肽FNZ能显著延长TT、APTT，但对PT无延长作用，说明FNZ主要作用于内源性凝血通路，而对外源性凝血通路无作用。FNZ对TT的延长时间较短，量效关系的线性范围较窄，而FNZ对APTT延长时间较长且线性范围较宽。以上结果说明本专利技术所述菲牛蛭素活性肽FNZ在体内具有抗凝活性，具有良好的临床应用前景。附图说明图1为本专利技术所述质粒载体的构建过程；图2为pET22b-HMb-1诱导表达结果；其中M：marker（红箭头表示为7.8kDa）；1：pET22b-HMb-1-1诱导前全菌；2：pET22b-HMb-1-1诱导后全菌；3：pET22b-HMb-1-1诱导后破碎上清；4：pET22b-HMb-1-1诱导后破碎沉淀；5：pET22b-HMb-1-2诱导前全菌；6：pET22b-HMb-1-2诱导后全菌；7：pET22b-HMb-1-2诱导后破碎上清；8：pET22b-HMb-1-2诱导后破碎沉淀。图3为菲牛蛭素G-25柱脱盐处理层析图谱；图4为口服不同剂量FNZ对兔PT延长的时-效曲线；图5为口服不同剂量FNZ对兔APTT延长的时-效曲线；图6为口服不同剂量FNZ对兔TT延长的时-效曲线。具体实施方式本专利技术公开了一种抗凝活性的菲牛蛭素多肽及其制备方法与用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术内。本专利技术的产品、方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。为了使本领域的技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明。实施例1：RT-PCR扩增菲牛蛭素基因片段取广西菲牛蛭活体，切取菲牛蛭头部组织（大约1-2cm），采用TRIzol（Invitrogen）法提取组织的总RNA。以提取的总RNA为模板，首先进行反转录得到cDNA。设计上游引物Hmgxup（如SEQIDNo.3所示）（ATGTTCTCTCTCAAGTTGTTCG）和下游引物Hmgxdn（如SEQIDNo.4所示）（TTAATTCAATATATCTTCATCTGGG），以cDNA为模板，PCR扩增菲牛蛭素基因，反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃60s，72℃45s（30次）；72℃10min。扩增产物如SEQIDNo.2所示。实施例2：表达质粒构建对实施例1所得基因进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种菲牛蛭素活性肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种菲牛蛭素活性肽，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。2.编码权利要求1所述菲牛蛭素活性肽的基因。3.根据权利要求2所述基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。4.权利要求1所述的菲牛蛭素活性肽的制备方法。5.根据权利要求4所述的制备方法，包含以下步骤：步骤1：以编码权利要求1所述菲牛蛭素活性肽的cDNA为模板；设计引物进行PCR扩增，上游引物如SEQIDNo.3所示，下游引物如SEQIDNo.4所示；步骤2：对扩增产物与质粒进行重组构建原核表达载体；将所得原核表达载体转入宿主细胞E.coliBL21（DE3）进行蛋白表达；步骤3：收集菌体，离心弃沉淀，收上清；向上清中加硫酸铵达硫酸铵浓度65-80%，静置后离心弃上清，取沉淀用pH7.4PBS溶解；步骤4：将步骤3所得溶解液超滤除杂，用0.1MNaCl溶液洗膜，收集穿过液；穿过液用G-25柱脱盐，收集层析图谱中第一个吸收峰，即得。6.根据权利要求5所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾继明，王宏涛，赵韶华，郑春杨，张会欣，鲍蓬，冯建敏，姜新刚，王海荣，
申请(专利权)人：河北以岭医药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13