本发明专利技术提供了用于快速测定药物偶联物连接于链间半胱氨酸残基所致的非共价结合抗体重链(HC)和抗体轻链(LC)的完整分子量的方法和系统。通过使用天然脱盐条件分析抗体-药物偶联物(ADC)，ADC的完整-二价结构得以维持，该二价结构通常会因LCMS常用的变性色谱条件而降解。随后使用去溶剂化和离子化的ESI-MS条件测定脱盐ADC的分子量。本文中描述的方法用于直接测量在链间半胱氨酸残基上偶联的ADC的完整分子量。本文描述的方法也用于个体ADC种类的相对定量测得。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术提供了用于快速测定药物偶联物连接于链间半胱氨酸残基所致的非共价结合抗体重链(HC)和抗体轻链(LC)的完整分子量的方法和系统。通过使用天然脱盐条件分析抗体-药物偶联物(ADC)，ADC的完整-二价结构得以维持，该二价结构通常会因LCMS常用的变性色谱条件而降解。随后使用去溶剂化和离子化的ESI-MS条件测定脱盐ADC的分子量。本文中描述的方法用于直接测量在链间半胱氨酸残基上偶联的ADC的完整分子量。本文描述的方法也用于个体ADC种类的相对定量测得。【专利说明】蛋白偶联的试剂化合物的整体分子量测定相关申请的交叉引用本申请要求2011年9月29日提交的美国临时申请序列号61/540，839和2012年9月12日提交的美国临时申请序列号61/701，489的优先权和利益，二者通过引用的方式将它们整体引入在此。专利技术背景抗体药物偶联物(Antibody Drug Conjugates, ADC)是将有效负荷祀向递送至革巴标的化合物。在许多实例中，靶标是肿瘤相关的抗原(TAA)，有效负荷是药物。抗体分为许多类别，包括IgGl和IgG2。IgGl和IgG2抗体的结构包括2条重链(HC)和2条轻链(LC)。两条重链和两条轻链表现为一复合体组成完整抗体。各IgGl抗体通过各抗体链上相应的半胱氨酸氧化形成12个链内和4个链间二硫键。在重链和轻链之间具有两个二硫键，在重链和重链之间具有两个二硫键。完全的还原IgG I抗体的链间二硫键会导致抗体复合物依靠非共价相互作用维持。完全还原IgG I抗体的链间二硫键会产生八个可使用的(accessible)硫醇以便与药物偶联，一般通过接头。改变还原参数能够得到具有O至8个硫醇以供偶联的抗体同分异构体。例如，使用DTT还原IgG I能够产生具有2、4、6或8个可用硫醇的抗体。充分还原的ADC靠非共价相互作用，例如氢键、离子键、疏水和范德华相互作用维持在一起，在变性条件下(例如，反相色谱)将会分离为轻和重链。非充分还原的ADC靠共价的和非共价相互作用维持在一起。在变性条件下，依靠共价键维持在一起的非充分还原的ADC也可能被分离。充分负载的IgG I ADC中的一个药物分子构成抗体的二硫键的每一个半胱氨酸，每个抗体总计有八个药物。部分负载的ADC —般具有2、4或6个药物分子连接在半胱氨酸残基上。也观察到部分负载的ADC具有1、3、5个药物分子连接在半胱氨酸残基上。虽然通过质谱(MS)测定了负载ADC的组成片段的分子量，但本专利技术所属领域仍存在测定负载ADC的整体分子量的问题。虽然缺乏直接测定负载ADC的整体分子量的技术，但已知测量负载ADC的整体分子量的各种间接手段。例如，采用以下方法测量ADC的分子量:在有低浓度有机溶剂或没有有机溶剂存在下，将样品(例如，ADC)结合至加热的反相高效液相色谱柱(rp-HPLC)，所述有机溶剂典型地也包含离子配对酸(例如，三氟乙酸)并且能将不挥发的盐和表面活性剂自样品中洗脱(通常称为脱盐)。在此例中，通过提高溶剂中有机组分的含量至某一点，在该点疏水的蛋白结构域和rp-HPLC色谱柱表面的相互作用被非极性有机溶剂破坏，从而将蛋白从rp-HPLC色谱柱上洗脱下来。该技术的不良影响是蛋白质结构因蛋白样品经历加热、酸和有机溶剂而破坏，其中任一因素都能使蛋白变性并破坏蛋白的结构。当非共价的蛋白复合物经历rp-HPLC时，它们会降解为构成它们的共价实体。以具有8个链间连接的半胱氨酸药物的IgGl抗体为例，在rp-HPLC柱上作脱盐导致ADC完全分解为每链3个药物的重链和每链I个药物的轻链。虽然可以通过质谱(MS)测定组分片段的分子量，但是本专利技术所属领域缺乏测定完整实体的分子量的方法。目前的MS技术无法测定ADC整体分子量，部分是因为这些技术导致蛋白的变性和/或就本文考虑的应用而言耗费太多时间。事实上蛋白的所有天然电喷雾电离(nativeelectrospray ionization) (ESI)质谱方法均规定该过程应在纳米喷雾(nanospray)水平(流速为100至500纳升/分钟)以最大程度降低蛋白结构的损坏，而这些损坏在标准ESI所用的加热护套和去溶剂化气体中可能发生。采用常规纳米喷雾ES1-MS技术测定ADC天然分子量的样品处理过程非常耗时并且无法满足高通量。即便不包括抗体去糖基化(deglycosylate)的时间，每个样品至少需要一小时才能获得分子量测定值。而且，分析链间半胱氨酸-连接的ADC的已知方法既不能满足在线质谱法(spectrometry)(例如，HIC),又在层析分离和随后的分子量测定(例如，rp-HPLC)过程中导致偶联的重链和轻链变性分解。因此，本专利技术所属领域需能够常规和快速地测定半胱氨酸-连接ADC的整体分子量的方法。令人意外地，通过提供检测非共价结合的蛋白药剂偶联物的分子量的方法、设备和系统，本专利技术满足了这一需求以及相关领域中其它未满足的需求。专利技术概述在第一方面,本专利技术提供了检测蛋白药剂偶联物(protein agent conjugate)分子量(mass)的方法。该方法包括以下步骤，在挥发性盐且不含非挥发性盐的条件下提供非共价结合且未变性的蛋白药剂偶联化合物(protein agent conjugate compound);将蛋白药剂偶联化合物引入质谱仪；和，通过质谱直接确立所述蛋白药剂偶联化合物的分子量。在第二方面，本专利技术提供了系统，例如，但不限于，设置为用于执行本文所述方法之一的质谱仪。附图简述图1显示MR为O至8的各种代表性ADC的IgGl结构，包括异构体，将抗体和药剂偶联产生，所述药剂，在一方面为药物，在另一方面为标记物，在还有另一方面为毒素。ADC中抗体(图中示为mAb) (MR = 0)亚基间的二硫连接桥连接于药物，产生非共价结合的2LC-2HC药物-连接的种类。图2显示在变性的和非变性条件下，与去糖基化mAb-A的分子量检测值相关的未处理的和去卷积的MS。在变性条件下获得的未处理的和去卷积的MS数据分别显示于图A和C中，在非变性条件下获得的未处理的和去卷积的MS数据分别显示于图B和D中。图B中在200和3500m/z之间(该区域是变性抗体明显的区域)明显的离子是存在用来去糖基化的PNG酶F (PNGase F)和非离子去垢剂吐温_80所致。图3显示在变性的和非变性条件下，去糖基化马来酰亚胺己酰基单甲基奥利司他汀 F(deglycosylated maleimidocaproyl monomethyl auristatin F, mcMMAF)偶联物ADC-A的分子量检测值相关的未处理和去积MS。在变性条件下获得的未处理和去卷积MS数据分别显示于图A和C中，在非变性条件下获得的未处理和去卷积MS数据分别显示于图B和D中。完整ADC-A的多个荷电离子在图B中用括号示出；图C和图D中存在的去卷积化人工结果用星号不出。图4显示去糖基化马来酰亚胺己酰基单甲基奥利司他汀F (mcMMAF)偶联物ADC-A和相应母体物质，mAb-A的去卷积质谱图。非共价结合的ADC结构显示在MS中相应离子上。图5显示去糖基化mc-Val-Cit-PAB单甲基奥利司他汀E(vcMMAE)偶联物ADC-B和相应母体物本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测蛋白药剂偶联化合物分子量的方法，包括：(a)在挥发性盐中且不含非挥发性盐中提供非共价结合的且未变性的蛋白药剂偶联化合物；(b)将所述蛋白药剂偶联化合物引入质谱仪；和(c)通过质谱直接确立所述蛋白药剂偶联化合物的分子量。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·F·瓦利耶尔道格拉斯，O·萨拉斯，
申请(专利权)人：西雅图基因公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。