肝祖细胞的条件培养基制造技术

本发明专利技术属于再生医学领域。已经发现，非卵圆的多能肝祖细胞的条件培养基发挥组织再生作用。因此，不含细胞的条件培养基制品可用于治疗损伤和器官衰竭、优选肝和/或损伤或衰竭。

【技术实现步骤摘要】
肝祖细胞的条件培养基本申请是国际申请日为2009年6月11日、国际申请号为PCT/EP2009/057232、进入国家阶段的申请号为200980131229.6、专利技术名称为“肝祖细胞的条件培养基”的PCT申请的分案申请。本专利技术属于生物药用制品和再生医学的领域。经证实，干细胞制品对人或动物组织发挥再生作用。测试生物人工肝支持物在治疗暴发性肝功能衰竭(FHF)中的效能的临床试验，已经提供了一些有希望的结果，然而现有的装置尚未表现出对于常规用途而言足够的效能和可靠性，主要是由于缺乏在功能上稳定的人肝细胞来源(KobayashiN,OkitsuT,TanakaN.Cellchoiceforbioartificiallivers.KeioJMed.2003;52(3):151-7)。肝干细胞或甚至源自其它组织的干细胞，可以潜在地提供人肝细胞的替代来源。除了骨髓以外，干细胞存在于成体组织（诸如肝和中枢神经系统）中，且具有比以前已知的大很多的可塑性。经证实，在国际专利申请WO2006/126236中所述的人肝多能祖/干细胞经历向多种组织细胞类型的分化，并发挥器官再生作用。这些细胞源自表达肝细胞标记物的非卵圆的人肝多能祖细胞系。国际专利申请WO2006/126236还公开了分离上述能经历向多种细胞类型的分化的人肝多能祖/干细胞的方法，所述方法包括下述步骤:(i)在细胞培养基中培养成体肝-衍生的人成熟肝细胞，直至成熟肝细胞死亡，并选择具有上皮样形态的存活细胞群；(ii)通过在含血清、含葡萄糖、补加hEGF(人上皮生长因子)和bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)并包含哺乳动物细胞生长必需的常见无机盐、氨基酸和维生素的培养基中培养，扩增具有上皮样形态的存活细胞群，且特别地，其中在有冷冻保护剂存在下，在含血清的培养基中冷冻成熟肝细胞，然后在根据步骤(i)培养之前解冻。WO2006/126236的人多能祖细胞(在专利说明书中指定为HLSC)及其制备方法通过引用完整地并入本文。经证实，间质干细胞(MSC)制品对组织发挥再生作用。例如，已知骨髓-衍生的间质干细胞通过分泌许多营养分子（包括可溶的胞外基质糖蛋白、细胞因子和生长因子）天然地支持血细胞生成。但是，干细胞制品的主要缺点是，在施用时造成免疫反应。某些干细胞制品甚至具有造成癌症的可能性。Parekkadan等人(ParekkadanB,vanPollD,SuganumaK,CarterEA,BerthiaumeF,TillesAW,YarmushML.Mesenchymalstemcell-derivedmoleculesreversefulminanthepaticfailure.PLoSONE.2007Sep26;2(9):e941)首次评估了不同的MSC-治疗，诸如递送条件培养基(CM)，以测试它们在诱发严重肝损伤的大鼠模型中的效能。在该文章中，给大鼠腹膜内地施用共2次D-半乳糖胺(Gal-N)注射。在第二个研究(VanPollD,ParekkadanB,ChoCH,BerthiaumeF,NahmiasY,TillesAW,YarmushML.Mesenchymalstemcell-derivedmoleculesdirectlymodulatehepatocellulardeathandregenerationinvitroandinvivo.Hepatology.2008Jan24;47(5):1634-1643)中，Parekkadan的研究组研究了MSC-CM的全身输注是否会在急性损伤的肝中产生肝保护应答，具体地通过抑制细胞死亡和刺激修复程序。该研究组使用D-半乳糖胺诱导的亚致死方案，证实了在MSC-CM治疗后显著的存活益处和肝酶释放的阻止。考虑到干细胞治疗的上述缺点，再生医学领域中现有的非常有效的制品通常含有细胞的事实，是应当克服的一个技术问题。因而，本专利技术的目的是，提供这样的制品，其可有效地用作再生医学领域中的药物组合物，但是其不含有细胞，从而避免含有细胞、尤其是干细胞的现有制品所造成的缺陷。本专利技术的另一个目的是，提供制备药物组合物的方法，所述药物组合物在再生医学领域中是有效的，但是其不含有细胞，从而避免含有细胞、尤其是干细胞的现有制品所造成的缺陷。通过独立权利要求中定义的制品和方法，实现这些和其它目的。从属权利要求涉及本专利技术的优选实施方案。从属权利要求和独立权利要求的主题构成说明书的一个完整部分。使用暴发性肝功能衰竭(FHF)的小鼠模型，专利技术人证实了通过培养肝祖细胞系（例如在WO2006/126236中公开的非卵圆的人肝多能祖细胞系）生成的无细胞的条件培养基(无细胞的CM)会对肝发挥再生作用。经证实，通过培养肝祖细胞系生成的无细胞的条件培养基(无细胞的CM)在器官衰竭的治疗（尤其是肝和肾衰竭的治疗）中是有效的。令人惊奇地，还发现，肝祖细胞系-CM比在相同条件下制备的间质干细胞-CM明显更有效。具体地，在本说明书的实施例1所述的研究中，给6至7周龄的雄性SCID小鼠腹膜内注射500µL含有0.125µgLPS和18mgD-半乳糖胺(GalN)的盐水，以诱导FHF。在施用LPS和GalN后30分钟、1和3小时后，给小鼠腹膜内注射3ml条件培养基，其源自在旋转生物反应器中培养的HLSC。条件培养基的初步分析揭示大量细胞因子、趋化因子和生长因子。丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶的血清水平在损伤诱导后显著增加，且在注射条件培养基治疗6天后显著降低。另一方面，通过BrdU、PCNA和Tunel测定法评价的肝组织的组织病理学分析揭示了降低的细胞凋亡和坏死指数和组织形态的恢复。这些研究提供了HLSC-衍生的条件培养基在炎症治疗和器官再生中的潜在治疗应用的第一份实验证据。因而，本专利技术的第一个方面是由无细胞的条件培养基组成的制品，所述无细胞的条件培养基可通过培养肝祖细胞系、优选非卵圆的人肝多能祖细胞系、更优选在国际专利申请WO2006/126236（其通过引用并入本文）中公开的非卵圆的人肝多能细胞系得到。包含有效量的上面定义的制品的药物组合物也落入本专利技术范围内。在下面，构成本专利技术主题的源自肝祖细胞系的无细胞的条件培养基将被称作“无细胞的HLSC-CM”。术语“HLSC”表示肝多能祖/干细胞系。优选地，术语“HLSC”表示非卵圆的肝多能细胞系，更优选地表示在WO2006/126236中公开的肝多能祖/干细胞系。更优选地，HLSC细胞系具有在WO2006/126236的权利要求1-10的任一项中定义的特征，和/或在WO2006/126236的第7页表I中总结的特征。这些特征通过引用并入本文。构成本专利技术主题的无细胞的HLSC-CM适合原样或以浓缩形式用作药物组合物。浓缩形式被浓缩了例如至少约5倍、优选至少约10倍、更优选至少约20倍、甚至更优选约25倍。优选地，从在技术人员已知的GMP条件下培养的肝多能祖/干细胞、优选在WO2006/126236中公开的HLSC细胞系，得到本专利技术的无细胞的HLSC-CM。或者，从在技术人员也已知的BAL(生物人工肝)系统中培养的肝多能祖/干细胞、优选在WO2006/126236中公开的HLSC细胞系，可以得到它。用于培养肝多能祖/干细胞和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种药物组合物，其包含药学有效量的至少肝细胞生长因子(HGF)、白介素?6?(IL?6)、白介素?8?(IL?8)和10??400?ng/ml的浓度的血管内皮生长因子(VEGF)的混合物。

【技术特征摘要】
2008.06.11 EP 08010651.11.一种药物组合物，其包含药学有效量的至少肝细胞生长因子(HGF)、白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)和10-400ng/ml的浓度的血管内皮生长因子(VEGF)的混合物，其中所述混合物另外包含药学活性量的巨噬细胞刺激蛋白(MSP)。2.根据权利要求1的药物组合物，其中所述肝细胞生长因子(HGF)是在1-100ng/ml的浓度，白介素6(IL-6)是在10-200ng/ml的浓度，白介素8(IL-8)是在等于或高于35ng/ml的浓度。3.根据权利要求1或2的药物组合物，其中所述巨噬细胞刺...

【专利技术属性】
技术研发人员：MB赫雷拉桑切斯，V方萨托，C特塔，G卡姆西，
申请(专利权)人：弗雷森纽斯医疗护理德国有限责任公司，
类型：发明
国别省市：