抑制淀粉样多肽聚集的复合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种抑制淀粉样多肽聚集的复合物及其制备方法和应用，所述复合物由短肽抑制剂和佐剂按1：5～10：1的摩尔比组成，所述短肽抑制剂选自β-淀粉样多肽的3-10个氨基酸的片段、其突变体及衍生物；所述佐剂选自含氮杂环化合物及其衍生物，所述复合物通过将短肽抑制剂与佐剂按1：5～10：1的摩尔比，溶解到缓冲液中制备混合溶液，使短肽抑制剂的终浓度为10-100μM，再孵育制得；所述复合物用于制备抑制淀粉样多肽对细胞毒害作用的药物或用于制备治疗和/或预防与淀粉样多肽有关的疾病的药物。本发明专利技术在分子水平上揭示分子与淀粉样多肽的相互作用，为研究药物分子与淀粉样多肽相互作用机理，提供了有效方法。

Compound for inhibiting amyloid peptide aggregation, preparation method and application thereof

The invention discloses a compound inhibiting the aggregation of amyloid polypeptide and its preparation method and the application of the compound by a short peptide inhibitor and adjuvant in 1:5 ~ 10:1 molar ratio, 3-10 amino acids of the short peptide inhibitor selected from beta amyloid peptide fragments, the mutant and the derivatives; the adjuvant is selected from the group consisting of nitrogen-containing heterocyclic compounds and their derivatives, the compound by peptide inhibitors and adjuvant according to the molar ratio of 1:5 to 10:1, dissolved into the buffer in preparation of mixed solution, the final concentration of peptide inhibitors for 10-100 M, then incubated prepared; the compound preparation for inhibition amyloid polypeptide drugs on cell toxicity or for the preparation of medicaments for the treatment and / or prevention related to amyloid polypeptide disease. The invention discloses the interaction between the molecule and amyloid polypeptide at the molecular level, and provides an effective method for studying the interaction mechanism of the drug molecule and the amyloid polypeptide.

【技术实现步骤摘要】
抑制淀粉样多肽聚集的复合物及其制备方法和应用本申请要求2012年7月16号提交的名称为“抑制淀粉样多肽聚集的复合物及其制备方法和应用”，申请号为201210246344.1的专利技术专利申请的优先权。
本专利技术属于生物医学
。本专利技术一般地涉及一种复合物，尤其涉及一种抑制淀粉样多肽聚集的复合物。本专利技术还涉及所述抑制淀粉样多肽聚集的复合物的制备方法和应用。通过本专利技术的抑制淀粉样多肽聚集的复合物，可以大大提高对淀粉样多肽的聚集和毒性的抑制效果。
技术介绍
淀粉样多肽的错误折叠和异常组装行为与人类很多退行性疾病的发病机制密切相关，如阿尔茨海默症(AD)、帕金森氏症(PD)、亨廷顿氏症(HD)、前额颞退行病变(FTLD)、脊索侧索硬化症(ALS)、II型糖尿病、牛海绵状脑病(BSE)、克罗伊茨费尔特-雅各布氏病(CJD)等以及某些癌症等。作为全球人口第一大国和老龄化社会的现状，退行性疾病造成严重的社会和家庭负担，成为我国必须面对的重大社会问题。以AD为例，它最重要的病理学特征之一为神经细胞外淀粉样物质沉积形成斑块,其主要组成成分β淀粉样蛋白(amyloid protein, A β ),是由跨膜的淀粉样前体蛋白(APP)经β和Y分泌酶水解产生的含有39-42个氨基酸残基的多肽。研究结果表明，淀粉样多肽通过聚集形成的寡聚体、原纤维、纤维都对神经细胞有毒害。通过进一步的研究，人们了解到位于Αβ 42中11-25 这段疏水区域是Αβ聚集的核心片段，尤其Αβ 16-20:KLVFF五肽片段尤为关键，不仅关系到Αβ的纤维化，而且可以识别Αβ相应区域，与Αβ发生特异性相互作用。(可参考Klein, ff.L.等人，Neurochemistry International2002, 41, 345; Lambert, Μ.P.; Klein, ff.L.等人,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof Americal998, 95, 6448.; Selkoe, D.J., Nature2003, 426, 900.；Tjernberg, L.0.等人，Journal of Biological Chemistryl996, 271(15), 8545-8548.)由此可知，如果以KLVFF等五肽序列为核心片段，设计一系列短肽类抑制剂，会有效的干扰Αβ -Αβ之间的相互作用，从而影响其聚集过程和神经毒性。目前的研究主要是利用有机合成的方法合成多肽抑制剂:(I)改变多肽序列，如在KLVFF的末端连接某些寡聚氨基酸成为KLVFF —寡聚氨基酸嵌段分子，可以增大KLVFF抑制A β聚集的能力，更有效地降低Αβ的神经毒性；(2)形成多聚体衍生物，如通过合成的方法连接成为树枝状多聚体，也可以有效与Αβ结合，抑制原纤维向纤维转化，并且促进聚集体的解聚；(3)末端增加有机配体，如在多肽的末端或者其他位置连接有效的有机小分子官能团，来增加多肽片段与A β的作用强度和对Aβ聚集以及神经毒性的抑制效果，也是效果显著的分子设计手段。(可参考 Chafekar, S.Μ.等人，ChemBiochem2007, 8 (15)，1857-1864.；Findeis,M.A.等人，Biochemistryl999, 38 (21)，6791-6800.；Gibson, T.J.等人，Biochemistry2005, 44 (24)，8898-8907.)由于涉及认知评价的模式动物评价过程复杂，对于淀粉样多肽的聚集和毒性抑制多采用细胞筛选的方法[可参考 T.L.Lowe，等人，〃Structure-function relationships forinhibitors of beta-amyloid toxicity containing the recognition sequence KLVFFjBiochemistry，40 (2001)，7882-89 ;Μ.M.Pallitto，等人Recognition sequence designfor peptidyl modulators of beta-amyloid aggregation and toxicity, Biochemistry, 38(1999)，3570-78.；T.Takahashi and H.MiharajPeptide and Protein MimeticsInhibiting Amyloid beta-Peptide Aggregation, Acc.Chem.Res.，41 (2008)，1309-18.]。上述报道的几种抑制淀粉样多肽毒性的方法，均从合成短肽类抑制剂的角度来实现对淀粉样多肽的聚集调控和神经毒性抑制的效果，目前尚未有利用非共价键作用制备短肽类抑制剂的方法。
技术实现思路
有助于理解本专利技术，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本专利技术相关领域的普通技术人员通常所理解的含义。除非另外说明，本文中的“抑制剂”指的是可以抑制淀粉样多肽的聚集和/或毒性的短肽。除非另外说明，本文中的“短肽”指的是可以抑制淀粉样多肽的聚集和/或毒性的多肽片段。除非另外说明，本文中的“佐剂”或“佐剂分子”指的是可以和抑制剂或者短肽相互作用，调节淀粉样多肽聚集行为和毒性的吡啶类和多酚类化合物。 除非另外说明，本文中的“抑制剂-佐剂复合物”指的是由短肽与吡啶类和多酚类化合物通过非共价相互作用形成的组装单元或者复合物，它可以抑制淀粉样多肽聚集和/或毒性。除非另外说明，本文中的“淀粉样多肽”指的是淀粉样多肽以及淀粉样多肽的片段。除非另外说明，在本文中，“ μ Μ”是指“ μ mol/L”，“mM”是指“mmol/L”。除非另外说明，本文中的“复合物”是指由两种或两种以上的不同物质所形成的结合体。例如，所述不同物质可通过相互结合，相互缔合或相互络合而形成结合体，如缀合物或络合物等。除非另外说明，本文中的“(:1-1^”是指“4’-氯-2，2’:6’，2”_三吡啶”，“EGCG”是指“(-)_表没食子儿茶素没食子酸酯”。针对现有技术的不足，本专利技术期望提供一种抑制淀粉样多肽毒性的新思路和新方法。因此，本文的一个目的是利用佐剂跟抑制剂形成的复合物及其在制备用于抑制淀粉样多肽对细胞毒害作用的药物中的用途。本文的另一个目的是提供该复合物在制备用于抑制淀粉样多肽对细胞毒害作用的抑制剂中的用途。本专利技术的又一个目的是提供该复合物在制备治疗和/或预防与淀粉样变有关的疾病药物中的用途。针对上述目的，本专利技术的技术方案如下: 一方面，本专利技术提供一种抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂-佐剂复合物，所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:5~10:1的摩尔比组成，优选地，所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:5~5:1组成，进一步优选地，所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:5~1:1的摩尔比组成，更优选地，所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:1的摩尔比组成；所述短肽抑制剂选自β -淀粉样多肽的3-10个氨基酸的片段、其突变体及衍生物，优选地，该短肽抑制剂的序列含有下述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂?佐剂复合物，所述复合物由短肽抑制剂和佐剂按1：5～10：1的摩尔比组成，优选地，所述复合物由短肽抑制剂和佐剂按1：5～5：1组成，进一步优选地，所述抑制剂?佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1：5～1：1的摩尔比组成，更优选地，所述抑制剂?佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1：1的摩尔比组成；所述短肽抑制剂选自β?淀粉样多肽的3?10个氨基酸的片段、其突变体及衍生物；优选地，所述短肽抑制剂的序列含有下述SEQ?ID?NO:1所示的氨基酸序列：KLVFF；所述佐剂选自吡啶类和多酚类化合物。

【技术特征摘要】
2012.07.16 CN 201210246344.11.一种抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂-佐剂复合物，所述复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:5~10:1的摩尔比组成，优选地，所述复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:5~5:1组成，进一步优选地，所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:5~1:1的摩尔比组成，更优选地，所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:1的摩尔比组成； 所述短肽抑制剂选自β -淀粉样多肽的3-10个氨基酸的片段、其突变体及衍生物；优选地，所述短肽抑制剂的序列含有下述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列:KLVFF ; 所述佐剂选自吡啶类和多酚类化合物。2.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述短肽抑制剂为Aβ16-20和/或Αβ 17-21，所述Αβ 16-20的序列为下述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列:KLVFF，所述Αβ 17-21的序列为下述SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列=LVFFA ;优选地，所述短肽抑制剂为 Αβ 16-20。3.根据权利要求1或2所述的复合物，其特征在于，所述多酚类化合物及其衍生物可选自(-)_表没食子儿茶素没食子酸酯、白藜芦醇、花青素、姜黄素和紫杉叶素中的一种或多种。4.根据权利要求1或2所述的复合物，其特征在于，所述吡啶类化合物为4，4’-联吡啶、1,2-二(4-吡啶基)乙烯、三联吡啶或4’-氯-2，2’:6’，2”_三吡啶。5.根据权利要求3或4所述的复合物，其特征在于，所述吡啶类化合物为4’ -氯-2，2’:6’，2”_ 三吡啶； 所述多酚类化合物为(-)_表没食子儿茶素没食子酸酯。6.根据权利要求1至5中任一项所述的复合物的制备方法，所述方法包括将短肽抑制剂与佐剂按1:5~10:1的摩尔比溶解到缓冲液中制备混合溶液，使短肽抑制剂的终浓度为10-100 μ Μ,再将混合溶液孵育形成抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂-佐剂复合物，优选地，使短肽抑制剂的终浓度为50 μ Μ,即得。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述短肽抑制剂和佐剂的摩尔比为1:5~5:1，优选地，所述短肽抑制剂和佐剂的摩尔比为1:5~1:1，更优选地，所述短肽抑制剂和佐剂的摩尔比为1:1 ;再优选地，所述缓冲液为ΡΗ6.8-7.5的磷酸盐缓冲液，更优选地，所述缓冲液为ΡΗ7.4的磷酸盐缓冲液；进一步优选地，所述混合溶液于室温孵育0.5-3小时，优选I小时。8.根据权利要求1至5中任一项所述的复合物在制备用于抑制淀粉样多肽聚集或对细胞毒害作用的药物中的应用。9.根据权利要求1至5中任一项所述的复合物在制备用于治疗和/或预防与淀粉样多肽有关的疾病的药物中的应用。10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述淀粉样多肽为阿尔茨海默氏病相关的β_淀粉样多肽、2型糖尿病相关的胰淀素、亨廷顿氏病相关的多聚谷氨酰胺、帕金森氏病相关的核突触蛋白、牛海绵状脑病和克罗伊茨费尔特-雅各布氏病相关的朊病毒； 优选地，所述淀粉样多肽为淀粉样多肽Αβ，更优选地，所述β-淀粉样多肽Αβ为β-淀粉样多肽A β 1-42、β-淀粉样多肽A β 1-40、β-淀粉样多肽A β 1-28、β -淀粉样多妝A β 33-42、β -淀粉样多妝A β 10-20及其片段，所述β ~淀粉样多妝A β 1-42的序列为SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列，所述β-淀粉样多肽A β 1-40的序列为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述β -淀粉样多肽Αβ 1-28的序列为SEQ ID Ν0:5所示的氨基酸序列，所述β -淀粉样多肽A β 33-42的序列为SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列，所述β -淀粉样多肽A β 10-20的序列为SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列；还优选地，所述淀粉样多肽为淀粉样多肽A β 1-42。11.一种抑制淀粉样多肽的聚集或神经毒性的方法，包括以下步骤: 步骤A:制备淀粉样多肽溶液，淀粉样多肽与短肽抑制剂的混合溶液、淀粉样多肽与佐剂的混合溶液，及淀粉样多肽与权利要求1至5中任一项所述的复合物的混合溶液，再将其于室温孵育； 步骤B:将孵育后的步骤A的溶液，利用原子力显微技术观察短肽抑制剂、佐剂、所述复合物对淀粉样多肽的聚集体形貌的影响。 步骤C:将孵育后的步骤A的溶液，利用荧光光谱技术测试短肽抑制剂、佐剂、所述复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果。 步骤D:将孵育后的步骤A的溶液，利用细胞毒性测试实验检测短肽抑制剂、佐剂、所述复合物对淀粉样多肽细胞毒性的抑制效果。12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤A具体包括以下步骤: 步骤Α.1:将淀粉样多肽溶解于缓冲液中，制成淀粉样多肽溶液，优选地，所述缓冲液为ρΗ=6.8-7.5的磷酸缓冲液,进一步优选地,所述磷酸缓冲液的pH为7.4 ; 步骤A.2:将淀粉样多肽分别与短肽抑制剂或佐剂，溶解于缓冲液中，制得短肽抑制剂和淀粉样多肽混合溶液及佐剂和淀粉样多肽混合溶液，优选地，将淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂溶解于pH=6.8-7.5的磷酸缓冲液中，于37°C孵育1_3天，更优选地，将淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂溶解于pH=6.8-7.5的磷酸缓冲液中，于37°C孵育2天； 步骤A.3:将短肽抑制剂和佐剂，溶解于缓冲液中，制得混合溶液，使短肽抑制剂的终浓度为10-125 μ Μ,优选10-100 μ M的溶液，再室温孵育形成抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂 -佐剂复合物溶液，优选地，使短肽抑制剂的终浓度分别为50 μ M或125 μ Μ，更优选地，将短肽抑制剂和佐剂溶解于ρΗ=6.8-7.5的磷酸缓冲液中，于室温孵育0.5-3小时，进一步优选地，将短肽抑制剂和佐剂溶解于ρΗ=7.4的磷酸缓冲液中，于室温孵育I小时； 步骤Α.4:将步骤Α.3得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨延莲，牛琳，王琛，刘磊，赵琼，徐萌，
申请(专利权)人：国家纳米科学中心，
类型：发明
国别省市：