一种植物microRNA表达载体、构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种载体的构建方法，特别涉及一种植物microRNA表达载体、构建方法及应用，用F/R1引物和F/R2引物分别克隆靶基因启动子序列和下游含一段microRNA结合的靶基因启动子序列，通过Nco Ⅰ/Nco Ⅰ双酶切、T4DNA连接酶连接的方法，分别替换pGFPGUSplus载体上GFP上游的35S序列，构建成两种载体，1#载体miRNA靶基因启动子驱动GFP，2#载体microRNA结合靶基因启动子序列驱动GFP，选取两个载体转化的转基因株系，观察主根根尖分生组织区域的GFP信号，对比分析GFP信号，可清晰展示植物microRNA对其靶基因调控前后的表达模式，本发明专利技术简化了常规的载体构建方法的操作步骤，降低了成本，提高了工作效率。

A Plant MicroRNA Expression Vector, Construction Method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种植物microRNA表达载体、构建方法及应用
本专利技术涉及一种载体的构建方法，特别涉及一种植物microRNA表达载体、构建方法及应用。
技术介绍
microRNAs(miRNAs)是表观遗传学研究的热点问题之一，广泛参与调控植物的生长、发育及逆境耐受性等生命活动。而miRNAs功能的行使主要依赖于其对相关靶基因的转录后调控，因此，解析miRNAs调控相关生命活动的机理，首要任务即为明确miRNAs对其靶基因在相关生命活动中的调控模式。目前，针对miRNAs对其靶基因调控模式的研究方法主要包括：qRT-PCR、RNA原位杂交及靶基因启动子驱动靶基因/抗剪切靶基因连GFP报告基因的载体构建。比较上述三种方法，qRT-PCR法难以对靶基因转录前后细胞水平的表达模式进行定位分析；RNA原位杂交可以实现对miRNAs及其靶基因的原位表达分析，但操作繁琐，工作量大；常规的载体构建方法，可通过比较报告基因的信号展示靶基因转录前后的表达水平，但就载体构建而言，需要同时克隆基因的启动子、基因编码序列和突变后的编码序列，工作量较大，另外不可避免基因本身编码的蛋白对报告基因蛋白空间构象的影响，容易出现构建好的载体，却看不到报告基因的信号。综上，现有技术存在的问题是常规的载体构建方法步骤繁琐，工作量大，且基因本身的蛋白对报告基因蛋白空间构象的影响，导致构建好的载体，看不见报告基因的信号。
技术实现思路
本专利技术简化了常规的载体构建方法，通过载体报告基因信号的观察可以展示靶基因转录前后的表达模式。本专利技术的第一个目的是提供一种植物microRNA表达载体的构建方法，包括如下步骤：针对靶基因启动子序列设计引物组合F/R1，用F/R1引物克隆靶基因启动子序列，测序验证，将测序正确的扩增片段通过NcoⅠ/NcoⅠ双酶切、T4DNA连接酶连接的方法连接到pGFPGUSplus载体上，即靶用克隆的基因启动子序列替换pGFPGUSplus载体上的GFP上游的35S序列，验证片段连接至pGFPGUSplus载体的方向，正向连接至pGFPGUSplus载体的质粒即为构建成功的1#载体，靶基因启动子驱动GFP；针对下游含目的microRNA的靶基因启动子序列设计引物组合F/R2，用F/R1引物克隆下游含目的microRNA的靶基因启动子序列，测序验证，对测序正确的扩增片段通过NcoⅠ/NcoⅠ双酶切、T4DNA连接酶连接的方法连接到pGFPGUSplus载体上，即用下游含一段microRNA结合的靶基因启动子序列替换pGFPGUSplus载体上的GFP上游的35S序列，进一步验证片段连接至pGFPGUSplus载体的方向，正向连接至pGFPGUSplus载体的质粒即为构建成功的2#载体，microRNA结合靶基因启动子序列GFP。本专利技术的第二个目的是提供一种上述构建方法构建得到的1#和2#载体。本专利技术的第三个目的是提供一种上述载体在分析植物microRNA对其靶基因调控模式的应用。优选地，所述植物为拟南芥。优选地，所述引物F序列如SEQIDNO：1所示；引物R1序列如SEQIDNO：2所示；引物R2序列如SEQIDNO：3所示。本专利技术与现有技术相比，具有如下技术效果：本专利技术简化了常规的载体构建方法，通过载体报告基因信号的观察可以展示靶基因转录前后的表达模式，大大简化了操作步骤，降低了成本，提高了工作效率；本专利构建的载体，可直观展示靶基因受microRNAs调控前后的组织细胞表达水平，为植物microRNAs对靶基因的调控模式研究提供了一种新方法。附图说明图1为本专利技术实施例1的构建方法示意图(A：pGFPGUSplus载体；B：靶基因启动子替代35S启动子后，获得的用于分析靶基因转录水平表达模式的载体；C：靶基因启动子后连接一段miRNA剪切结合的靶基因的序列)。图2为本专利技术实施例1构建载体的启动子克隆电泳检测结果。图3为本专利技术实施例1构建载体连接方向的电泳检测结果。图4为本专利技术实施例2构建成功的两个载体分别转化拟南芥获得的转基因苗的筛选(A为1#载体pMYB33-GFP转化，B为2#载体pMYB33-miR159-GFP转化)。图5为本专利技术实施例2两种载体GFP信号观察图(A：MYB33在拟南芥根尖分生组织区域的转录水平，B：MYB33受miR159剪切的转录后水平的表达模式)。具体实施方式下面结合具体实施例和附图对本专利技术进行详细说明，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的方法，通常按照常规条件操作，未注明的材料来源均为市售，由于不涉及专利技术点，故不对其步骤进行详细描述。实施例1一种植物microRNA表达载体的构建方法本实施例选取拟南芥miR159的靶基因MYB33进行载体的构建(构建方法如图1所示)，表达载体为pGFPGUSplus载体(购买至普如汀生物技术(北京)有限公司)，选取MYB33基因ATG上游2051bp序列进行引物设计；引物F序列如SEQIDNO：1所示：引物R1序列如SEQIDNO：2所示；引物R2序列如SEQIDNO：3所示；(1)克隆MYB33启动子序列以拟南芥的基因组DNA为模板，利用F/R1引物组合进行扩增，PCR体系为：1μL模板DNA、两条引物各1μL且浓度均为10μmol/L、10μL的5×Buffer、2.5mmol/L的dNTPs取4μL、1μLTransTaqHiFiDNAPolymerase、ddH2O补足50μL；PCR反应条件：94℃5min，94℃30s、53℃30s、72℃2min，35次循环，72℃8min、4℃保存。(2)克隆下游含目的microRNA的靶基因启动子序列以拟南芥的基因组DNA为模板，利用F/R2引物组合进行扩增，PCR体系为：1μL模板DNA、两条引物各1μL且浓度均为10μmol/L、10μL的5×Buffer、2.5mmol/L的dNTPs取4μL、1μLTransTaqHiFiDNAPolymerase、ddH2O补足50μL；PCR反应条件：94℃5min，94℃30s、53℃30s、72℃2min，35次循环，72℃8min、4℃保存。将上述扩增产物进行电泳检测并测序验证，电泳结果为图2所示，MYB33启动子克隆测序验证为SEQIDNO.4所示，记做片段1；MYB33启动子连接一段miR159剪切结合MYB33的21bp序列克隆测序验证为SEQIDNO.5所示，记做片段2。将测序验证正确的扩增片段通过NcoⅠ酶切、T4DNA连接酶连接的方法连接到pGFPGUSplus载体上。为了验证片段1和片段2连接入pGFPGUSplus载体的方向，筛选出正向插入的目标载体，我们设计了一对引物(靠近MYB33启动子3’端设计引物F2，序列如SEQIDNO：6所示；靠近GFP5’端设计引物R3，序列如SEQIDNO7：所示)，以连接片段1和片段2的pGFPGUSplus载体DNA为模板，通过PCR进行筛选验证，能够成功扩增出目标大小片段的克隆即为构建成功的载体。PCR体系为：模板DNA1μL、两条引物各1μL且浓度均为10μmol/L、10μL的2×Taqmix、ddH2O补足20μL；PCR反应条件：94℃5min，94℃30s本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种植物microRNA表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：针对靶基因启动子序列设计引物组合F/R1；用F/R1引物组合克隆靶基因启动子序列，测序验证，将测序正确的扩增片段通过NcoⅠ/NcoⅠ双酶切、T4DNA连接酶连接的方法连接到pGFPGUSplus载体上，即用克隆的靶基因启动子序列替换pGFPGUSplus载体上的GFP上游的35S序列，验证片段连接至pGFPGUSplus载体的方向，正向连接至pGFPGUSplus载体的即为构建成功的1#载体，靶基因启动子驱动GFP；针对下游含目的microRNA的靶基因启动子序列设计引物组合F/R2；用F/R2引物组合克隆下游含目的microRNA的靶基因启动子序列，测序验证，对测序正确的扩增片段通过Nco Ⅰ/Nco Ⅰ双酶切、T4 DNA连接酶连接的方法连接到pGFPGUSplus载体上，即用下游含microRNA的靶基因启动子序列替换pGFPGUSplus载体上的GFP上游的35S序列，进一步验证片段连接至pGFPGUSplus载体的方向，正向连接至pGFPGUSplus载体的即为构建成功的2#载体，microRNA结合靶基因启动子序列驱动GFP。...

【技术特征摘要】
1.一种植物microRNA表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：针对靶基因启动子序列设计引物组合F/R1；用F/R1引物组合克隆靶基因启动子序列，测序验证，将测序正确的扩增片段通过NcoⅠ/NcoⅠ双酶切、T4DNA连接酶连接的方法连接到pGFPGUSplus载体上，即用克隆的靶基因启动子序列替换pGFPGUSplus载体上的GFP上游的35S序列，验证片段连接至pGFPGUSplus载体的方向，正向连接至pGFPGUSplus载体的即为构建成功的1#载体，靶基因启动子驱动GFP；针对下游含目的microRNA的靶基因启动子序列设计引物组合F/R2；用F/R2引物组合克隆下游含目的microRNA的靶基因启动子序列，测序验证，对测序正确的扩增片段通过NcoⅠ/NcoⅠ双酶切、...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛涛，晁秋杰，苏多猛，段永波，朱艳芳，藤井通，张爱民，盛玮，薛建平，
申请(专利权)人：淮北师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34