检测基因编辑事件以及测定基因编辑效率的方法以及其应用技术

本发明专利技术首次提供了利用外源核苷酸片段检测基因编辑工具例如CRISPR/Cas9在植物细胞中产生基因编辑事件以及测定基因编辑效率的方法，并结合不同核苷酸结构的片段在水稻原生质体中加以应用的范例。

Detecting Gene Editing Events and Measuring Gene Editing Efficiency and Its Application

【技术实现步骤摘要】
检测基因编辑事件以及测定基因编辑效率的方法以及其应用
本专利技术涉及分子生物学、植物遗传学和植物生物工程领域。具体而言，本专利技术涉及基因编辑产物在植物细胞中的检测方法，特别地涉及通过编辑水稻原生质体的靶基因能够检测基因编辑工具在植物细胞中产生的编辑事件以及测定其编辑效率。该方法能够应用于基因编辑工具在植物细胞中的活性比较以及优化。
技术介绍
基因编辑是目前生命科学研究的一个热点，目前广泛使用的基因编辑技术中的重要工具CRISPR/Cas9(ClusteredRegularlyInterspacedPalindromicRepeats/CRISPR-associated9)是细菌和古细菌的对抗外源DNA入侵的一种防御系统，可将入侵的噬菌体基因组DNA等外源核酸序列切除。此外还有人工设计的序列特异性核酸酶(Sequence-specificnucleases，SSNs)来对特定位置的基因组DNA进行切割，如早期的锌指核酸酶(ZincFingerNuclease，ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(TranscriptionActivator-LikeEffectorNuclease，TALEN)、归巢核酸内切酶(MegaNuclease，MN)。这些基因编辑工具均在基因组的特定位置产生DNA双链断裂(Double-strandbreaks，DSBs)，DSB可以由生物体的体内修复机制完成核苷酸的序列变化(缺失、插入和替换)。其中CRISPR/Cas9自首次报道在生物体内实现基因编辑以来，由于其操作简单、效率高，所以该系统广泛应用于动植物，成为药物开发、疾病治疗和农作物品质改良等领域的一个重要基因编辑工具，具有广泛应用前景。真核生物细胞有两种修复系统实现体内DNA的DSB修复。同源重组(Homologousrecombination，HR)和非同源末端连接(non-homologousendjoining，NHEJ)。HR需要以同源DNA片段作为模板进行修复，可实现核苷酸精确改变，但HR在植物体内的效率非常低。NHEJ不需要额外提供同源片段，依赖体内核酸酶活性，在DSB处产生少数核苷酸的改变，包括插入或缺失。NHEJ是植物中的一条主要修复途径。目前针对HR和NHEJ活性的检测依赖于荧光报告系统，荧光报告基因通过切割产生DSB，然后HR或NHEJ修复后恢复荧光基因活性，流式细胞仪统计发光细胞的数量从而计算HR或NHEJ的活性。此外，也可利用微滴数字PCR(dropletdigitalPCR，ddPR)检测模板DNA中DSB的修复数量，以及高通量的深度测序也可灵敏地检测DNA修复产物的数量。在植物基因组编辑研究中检测基因编辑事件的方法除上述方法外，还发展了很多方法。如最常用的PCR/RE方法，该方法是应用特异引物PCR和限制性酶切相结合产生的一种检测方法，主要通过对PCR扩增的DNA片段进行限制性酶切分析来区分目标位点是否被编辑。该方法虽然简单、成本低，但需要在基因组编辑核酸酶切割位点需要有限制性酶切位点。此外，还有错配切割法，其是通过错配切割酶识别并切割异源双链核酸分子进行检测的一种方法。常用的错配切割酶为T7EI、Surveyor(CelI)和Cruiser。错配切割酶的优势在于不受限制性酶切位点的限制，但错配切割酶受核酸特定结构如Holiday或Cruciform影响存在一定假阳性。基因编辑技术近年来发展迅速，大量高效编辑系统被开发出来。尤其以CRISPR/Cas9为核心的编辑技术广泛应用于动植物研究和开发。随着越来越多植物基因组编辑的应用，一种灵敏、简便的检测基因编辑事件的方法迫切所需。尽管高通量测序技术由于准确、灵敏和成本低等优势，广泛应用于哺乳动物细胞基因编辑事件的检测，但是植物由于基因组复杂并且植物细胞系难获得而较少采用高通量测序技术检测基因编辑事件。近几年植物基因组编辑的检测方法应用差别很大，说明现有这些方法各有局限，需要根据植物种类和目标基因进一步优化或改进。比较现有基因编辑事件的检测方法，当基因频率很低时，直接利用PCR扩增并进行SangerDNA测序很难获得突变类型，甚至用高通量测序法(NGS)进行全基因组分析也无法获得突变类型，并且由于植物多倍性，使得高通量测序法在不同物种中应用受局限。对PCR产物进行酶切(PCR/RE)的方法(需要在基因组编辑核酸酶切割位点有限制性酶切位点)，或者通过荧光报告基因恢复发光功能统计基因编辑事件频率，均对目标基因和靶位点的选择具有局限性。
技术实现思路
在一个方面，本专利技术涉及一种检测植物细胞中发生基因编辑事件的方法，其包括由选定的基因编辑工具产生DNA双链断裂，并将所提供的外源核苷酸片段由体内修复系统通过NHEJ途径插入断裂处，从而使得该基因编辑事件能够只通过PCR扩增就被检测到，其中所述外源核苷酸片段不含有大于6个连续核苷酸的与所述植物的基因组同源的序列。在另一个方面，本专利技术涉及一种测定植物细胞中基因编辑效率的方法，其包括将选定的基因编辑工具和外源核苷酸片段与报告基因一起共同转化植物细胞，由所述基因编辑工具产生DNA双链断裂，将所述外源核苷酸片段由体内修复系统通过NHEJ途径插入断裂处，进行PCR扩增和对扩增片段进行测序，和基于测序结果和借助于报告基因而获得的转化效率来计算出基因编辑效率，其中所述外源核苷酸片段含有兼并碱基。在一个优选的实施方案中，所述兼并碱基选自由下列各项组成的组：(1)兼并碱基N，其表示A、T、C或G；(2)兼并碱基D，其表示A、T或G；(3)兼并碱基H，其表示A、T或C；(4)兼并碱基V，其表示A、C或G；(5)兼并碱基B，其表示T、C或G；(6)兼并碱基R，其表示A或G；(7)兼并碱基W，其表示A或T；(8)兼并碱基M，其表示A或C；(9)兼并碱基Y，其表示T或C；(10)兼并碱基K，其表示T或G；和(11)兼并碱基S，其表示C或G。在一个进一步优选的实施方案中，所述报告基因是绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白或黄色荧光蛋白的基因。在根据上述两个方面的一个优选的实施方案中，所述外源核苷酸片段由人工合计并合成，并且以单链DNA或双链DNA形式。在根据上述两个方面的另一个优选的实施方案中，所述外源核苷酸片段的5’末端含有磷酸化修饰。在根据上述两个方面的另一个优选的实施方案中，所述外源核苷酸片段的两端含有硫代磷酸修饰。在根据上述两个方面的另一个优选的实施方案中，所述外源核苷酸片段的5’末端含有磷酸化修饰，并且两端含有硫代磷酸修饰。在根据上述两个方面的另一个优选的实施方案中，所述外源核苷酸片段的序列如SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO:7所示。在根据上述两个方面的另一个优选的实施方案中，所述基因编辑工具为CRISPR/Cas9、TALEN、MN或ZFN。在一个进一步优选的实施方案中，所述Cas9的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，或者所述Cas9的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。在一个进一步优选的实施方案中，在所述基因编辑工具为CRISPR/Cas9，并且用于实施编辑的导向RNA是单组分RNA或双组分RNA。在一个进一步优选的实施方案中，所述导向RNA的骨架核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。在根据上述两个方面的另一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测植物细胞中发生基因编辑事件的方法，其包括由选定的基因编辑工具产生DNA双链断裂，并将所提供的外源核苷酸片段由体内修复系统通过NHEJ途径插入断裂处，从而使得该基因编辑事件能够只通过PCR扩增就被检测到，其中所述外源核苷酸片段不含有大于6个连续核苷酸的与所述植物的基因组同源的序列。

【技术特征摘要】
1.一种检测植物细胞中发生基因编辑事件的方法，其包括由选定的基因编辑工具产生DNA双链断裂，并将所提供的外源核苷酸片段由体内修复系统通过NHEJ途径插入断裂处，从而使得该基因编辑事件能够只通过PCR扩增就被检测到，其中所述外源核苷酸片段不含有大于6个连续核苷酸的与所述植物的基因组同源的序列。2.一种测定植物细胞中基因编辑效率的方法，其包括将选定的基因编辑工具和外源核苷酸片段与报告基因一起共同转化植物细胞，由所述基因编辑工具产生DNA双链断裂，将所述外源核苷酸片段由体内修复系统通过NHEJ途径插入断裂处，进行PCR扩增和对扩增片段进行测序，和基于测序结果和借助于报告基因而获得的转化效率来计算出基因编辑效率，其中所述外源核苷酸片段含有兼并碱基。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述兼并碱基选自由下列各项组成的组：(1)兼并碱基N，其表示A、T、C或G；(2)兼并碱基D，其表示A、T或G；(3)兼并碱基H，其表示A、T或C；(4)兼并碱基V，其表示A、C或G；(5)兼并碱基B，其表示T、C或G；(6)兼并碱基R，其表示A或G；(7)兼并碱基W，其表示A或T；(8)兼并碱基M，其表示A或C；(9)兼并碱基Y，其表示T或C；(10)兼并碱基K，其表示T或G；和(11)兼并碱基S，其表示C或G。4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述报告基因是绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白或黄色荧光蛋白的基因。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述外源核苷酸片段由人工合计并合成，并且以单链DNA或双链DNA形式。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述外源核苷酸片段的5’...

【专利技术属性】
技术研发人员：许建平，李江，
申请(专利权)人：先正达生物科技中国有限公司，先正达作物保护股份公司，
类型：发明
国别省市：北京,11