本发明专利技术涉及植物基因工程领域，具体涉及一种辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆的Cre‑LoxP重组系统及其应用。本发明专利技术提供了一种辣椒轻斑驳病毒PMMoV‑GFP侵染性克隆的Cre‑LoxP重组系统，其包括pJM23载体、pJG102载体和pCre载体。进一步通过采用将Cre基因与pJG102载体融合的方式，简化Cre‑LoxP重组系统载体数量，构建了由pJM23载体和pJG2303载体所组成的PMMoV‑GFP侵染性克隆的Cre‑LoxP重组系统。通过本发明专利技术所述的Cre‑LoxP重组系统降低了对PMMoV全序列改造的难度，提高了PMMoV外源蛋白表达系统的可操作性。
Re-LoxP recombinant system for infectious cloning of Capsicum mild mottle virus and its application
【技术实现步骤摘要】
辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统及其应用
本专利技术涉及植物基因工程领域，具体涉及一种辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统及其应用。更具体地，涉及利用Cre-LoxP重组系统实现携带外源GFP基因的辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆载体的重组。
技术介绍
辣椒轻斑驳病毒(peppermildmottlevirus,PMMoV)属于烟草花叶病毒属(Tobamovirus)成员，病毒粒体呈直杆状，为正单链RNA病毒，基因组由6357个核苷酸组成，共有4个开放阅读框架(openreadingframes,ORFs)，编码4个蛋白，分别编码病毒复制酶蛋白p126(70-3421nt)、病毒复制酶蛋白p183(70-4906nt)、运动蛋白MP(movementprotein,4909-5680nt)和外壳蛋白CP(coatprotein,5685-6156nt)。PMMoV是危害辣椒生产的重要病毒之一，植株被侵染后表现出斑驳或黄绿相间的花叶症状，果实被侵染后出现畸形、斑驳，引起辣椒落叶、落花、落果，在全世界范围内严重威胁着辣椒的生产。Cre重组酶是大肠杆菌P1噬菌体cre基因的38.5kDa产物，其能识别并催化LoxP位点间的重组。LoxP是一段长度为34bp的DNA序列，包括被8bp间隔的2个13bp的反向重复序列，每个反向重复及其临近的4bp构成一个Cre蛋白结合区，其序列如下：ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT。间隔的非对称性决定了LoxP位点具有方向性。Cre重组酶不需要其他一些辅助因子即能特异性识别LoxP位点，完成活体内和体外细胞中的DNA重组。Cre介导的重组过程是一个动态、可逆的过程，根据LoxP位点位置可以分成三种情况：(1)如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；(2)如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位；(3)如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。通过在目的基因序列中引入LoxP序列，利用Cre酶诱导LoxP位点进行特异性整合或重组，以期实现更简单、更有效地对目的基因组进行遗传修饰和改造，促进对基因功能的研究。
技术实现思路
本专利技术将携带外源GFP基因的辣椒轻斑驳病毒(Peppermildmottlevirus，PMMoV)侵染性克隆载体拆分为约4kb和2kb载体，在相应目的片段引入LoxP序列，利用Cre酶诱导LoxP位点在植物体内重组形成完整的PMMoV-GFP病毒序列，从而产生具有侵染活性的PMMoV-GFP病毒粒子。本专利技术的目的之一是提供一种辣椒轻斑驳病毒PMMoV-GFP侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统。在一些优选方式中，所述Cre-LoxP重组系统包括pJM23载体、pJG102载体和pCre载体。在一些优选方式中，所述pJM23载体由PMMoV-GFP侵染性克隆序列的RdRp(p126/p183)以及MP部分序列融入pCB301构建得到，其3’末端引入内含子前半部分序列(5’-gtaggtttcattttcataattacacaaatttagatttgatttttgtt-3’)及LoxP序列(5’-ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat-3’)，所述pJM23载体的核苷酸序列如SEQIDNo.14所示。在一些优选方式中，所述pJM102载体由PMMoV-GFP侵染性克隆序列的MP另一部分序列、GFP、CP融入pCB301构建得到，其5’末端引入内含子后半部分序列(5’-ttttattacatgtttgaacttcaacaatttatgactttttgttcttattgttgcag-3’)及LoxP序列(5’-ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat-3’)，所述pJM102载体的核苷酸序列如SEQIDNo.15所示。在一些优选方式中，所述pCre载体由Cre序列融入双元表达载体构建得到。在一些优选方式中，所述PMMoV-GFP侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统的构建方法包括以下步骤：(1)获得PMMoV-GFP侵染性克隆的核苷酸全序列；(2)设计引物pJM23-1f/r,pJM23-2f/r,pCB301-fullf/r，扩增引入LoxP序列的目的片段，利用Vazyme的ClonExpressMultiSOneStepCloningKit将PCR扩增获得的pJM23-1、pJM23-2、pCB301-full片段直接重组构建成pJM23载体；(3)设计引物pJG102f/r，pCB301-102f/r，扩增引入LoxP序列的目的片段，利用Vazyme的ClonExpressIIOneStepCloningKit将PCR扩增获得的pJG102、pCB301-102(将pCB301缺失35S启动子)片段直接重组构建成pJG102载体；(4)设计引物pCref/r扩增Cre基因片段，利用XbaI和SacI双酶切连入双元表达载体后构建得到pCre载体；(5)将上述三种载体采用农杆菌介导法共转化本氏烟，体内Cre基因表达后获得重组的PMMoV-GFP侵染性克隆。作为优选，所述的引物的碱基序列如SEQIDNo.2～SEQIDNo.13所示。本专利技术的另一个目的是提供另外一种辣椒轻斑驳病毒PMMoV-GFP侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统。在一些优选方式中，所述Cre-LoxP重组系统包括pJM23载体和pGJ2303载体。在一些优选方式中，所述pJM23载体由PMMoV-GFP侵染性克隆序列的RdRp(p126/p183)以及MP部分序列融入pCB301构建得到，其3’末端引入内含子前半部分序列(5’-gtaggtttcattttcataattacacaaatttagatttgatttttgtt-3’)及LoxP序列(5’-ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat-3’)，所述pJM23载体的核苷酸序列如SEQIDNo.14所示；所述pJG2303载体由pJG102载体和35S-Cre-RZ-NOS融合而成，其核苷酸序列如SEQIDNo.16所示。在一些优选方式中，所述的PMMoV-GFP侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统的构建方法包括以下步骤：(1)获得PMMoV-GFP侵染性克隆的核苷酸全序列；(2)设计引物pJM23-1f/r,pJM23-2f/r,pCB301-fullf/r，扩增引入LoxP序列的目的片段，利用Vazyme的ClonExpressMultiSOneStepCloningKit将PCR扩增获得的pJM23-1、pJM23-2、pCB301-full片段直接重组构建成pJM23载体；(3)设计引物pJG2303f/r，pCB301-full-RHf/r，扩增将35S-Cre-RZ-NOS序列利用Vazyme的ClonExpressIIOneStepCloningKit引入pJG102载体，重组构建得到pJG2303载体；本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种辣椒轻斑驳病毒PMMoV‑GFP侵染性克隆的Cre‑LoxP重组系统，其特征在于，所述Cre‑LoxP重组系统包括pJM23载体、pJG102载体和pCre载体。
【技术特征摘要】
1.一种辣椒轻斑驳病毒PMMoV-GFP侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统，其特征在于，所述Cre-LoxP重组系统包括pJM23载体、pJG102载体和pCre载体。2.根据权利要求1所述的Cre-LoxP重组系统，其特征在于，所述pJM23载体由PMMoV-GFP侵染性克隆序列的RdRp(p126/p183)以及MP部分序列融入pCB301构建得到，其3’末端引入内含子前半部分序列(5’-gtaggtttcattttcataattacacaaatttagatttgatttttgtt-3’)及LoxP序列(5’-ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat-3’)，所述pJM23载体的核苷酸序列如SEQIDNo.14所示。3.根据权利要求1所述的Cre-LoxP重组系统，其特征在于，所述pJM102载体由PMMoV-GFP侵染性克隆序列的MP另一部分序列、GFP、CP融入pCB301构建得到，其5’末端引入内含子后半部分序列(5’-ttttattacatgtttgaacttcaacaatttatgactttttgttcttattgttgcag-3’)及LoxP序列(5’-ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat-3’)，所述pJM102载体的核苷酸序列如SEQIDNo.15所示。4.根据权利要求1所述的Cre-LoxP重组系统，其特征在于，所述pCre载体由Cre序列融入双元表达载体构建得到。5.根据权利要求1所述的PMMoV-GFP侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统，其特征在于，所述重组系统的构建方法包括以下步骤：(1)获得PMMoV-GFP侵染性克隆的核苷酸全序列；(2)设计引物pJM23-1f/r，pJM23-2f/r，pCB301-fullf/r，扩增引入LoxP序列的目的片段，利用Vazyme的ClonExpressMultiSOneStepCloningKit将PCR扩增获得的pJM23-1、pJM23-2、pCB301-full片段直接重组构建成pJM23载体；(3)设计引物pJG102f/r，pCB301-102f/r，扩增引入LoxP序列的目的片段，利用Vazyme的ClonExpressIIOneStepCloningKit将PCR扩增获得的pJG102、pCB301-102(将pCB301缺失35S启动子)片段直接重组构建成pJG102载体；(4)设计引物pCref/r扩增Cre基因片段，利用XbaI和SacI双酶切后连入双元表达载体构建得到p...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭杰军，郑红英，赵晋平，钱靖，燕飞，鲁宇文，林林，程晔，陈剑平，
申请(专利权)人：宁波大学，浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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