提高番茄CRISPR/Cas9基因编辑效率的方法技术

本申请涉及基因编辑领域，特别地涉及CRISPR/Cas9在番茄中的基因编辑。本申请提高了CRISPR/Cas9在番茄中基因编辑的效率。

Methods for Improving the Editing Efficiency of CRISPR/Cas9 Gene in Tomato

【技术实现步骤摘要】
提高番茄CRISPR/Cas9基因编辑效率的方法
本申请涉及基因编辑领域，特别地涉及提高CRISPR/Cas9在番茄中的基因编辑的效率。
技术介绍
CRISPR/Cas9系统是近年来应用最为广泛的基因编辑系统，它由核酸酶Cas9和一个向导RNA(singleguideRNA，sgRNA)组成，共同介导了目标位点的切割，进而通过细胞的内源修复系统带来突变。目前CRISPR/Cas9技术已经在越来越多的植物中得到应用。番茄(Solanumlycopersicum)是最主要的蔬菜作物之一，而且由于其遗传简单、容易转化、生命周期短等特点，也是一个非常重要的模式植物。随着CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物中的广泛应用，提高CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率也变得非常迫切。目前报道的提高基因编辑效率的方法很多，其中包括对核酸酶蛋白进行密码子优化，选用不同的启动子驱动核酸酶的表达，选用不同的启动子驱动sgRNA的表达，优化sgRNA的结构，在核酸酶蛋白的两端加不同数量的NLS等等。其中以对核酸酶做密码子优化的报道居多。最早报道的CRISPR/Cas9在植物上应用的文章大多是以人类基因偏好密码子优化的Cas9，这些蛋白在植物上也有酶活性(Feng等人,2013；Mao等人,2013；Nekrasov等人,2013；Xie等人,2013)，不过编辑的效率都不高。植物基因偏好密码子优化的Cas9能显著地提高其在植物中的基因编辑效率(Li等人,2013)，因而近期发表的大部分文章都使用了植物基因偏好密码子优化的Cas9(Shan等人,2013；Zhang等人,2014；Wang等人,2014)。Sun等人比较了在大豆中使用大豆内源U6和拟南芥U6驱动相同sgRNA的编辑效率，结果显示大豆内源U6介导的sgRNA表达可以显著提高Cas9的编辑效率(Sun等人,2015)。Du等人的工作也得出了类似的结论，应用拟南芥U6启动子驱动sgRNA在大豆上取得了12.5％的编辑效率，而使用大豆内源的U6启动子取得了43.4％-48.1％的编辑效率，说明使用作物自身的启动子驱动sgRNA的表达可以显著地提高基因编辑的效率(Du等人,2016)。番茄中大多是使用拟南芥的U6驱动sgRNA的表达，Pan等人曾通过生物信息学的方法找到了7个番茄的U6启动子，但是并没有在实验中验证这些启动子驱动sgRNA进行基因编辑的数据(Pan等人,2017)。蒲艳等人也尝试了四个不同番茄内源的U6用于番茄基因编辑，其中一个在瞬时转化中取得了编辑，但是效率比较低(蒲艳等人,2018)。CRISPR/Cas系统中sgRNA的结构也会对编辑效率产生很大影响。Dang等人对sgRNA的结构进行了优化并显著地提高了CRISPR/Cas9的基因编辑效率(Dang等人,2015)。CRISPR/Cas12a(Cpf1)对gRNA的结构有更高的要求，Tang等人证明在gRNA的两端加上HH和HDV的核酶结构，用II型启动子驱动，可以大大地提高其在植物中的基因编辑效率(Tang等人,2017)。之后的有关Cas12a的编辑文章也大都采用这样的结构(Lee等人,2018；Malzahn等人,2019)。核定位信号(NLS)的优化也是另一个提高基因编辑效率的方法。Liu等人通过串联多个NLS提高了锌指核酸酶蛋白的编辑效率(Liu等人,2015)。另外，N-端串联四个核定位信号(NLS)可以显著地提高Cas9蛋白进入细胞核的能力(DOUDNA,JenniferA,WO2017/106569A1)。Liu等人在Cas12a的C-端串联两个NLS表明能显著增加它在动物细胞中的编辑效率(Liu等人,2019)。LeBlanc等人在拟南芥生长的过程中，对其进行了10天37℃30小时22℃42小时间断的高温处理，从而提高了CRISPR/Cas9在下一代的编辑效率(LeBlanc等人,2018)。CRISPR/Cas9在植物瞬时转化中，提高温度也可以提高其编辑效率(Malzahn等人,2019)，但是目前还没有在稳定转化过程中高温处理外植体可以提高CRISPR/Cas9基因编辑效率的报道。
技术实现思路
本专利技术涉及一种用CRISPR-Cas9在番茄中进行基因编辑的方法，其特征在于，所述的方法包括下列步骤：a)构建由CRISPR-Cas9介导的植物基因编辑载体；b)将在步骤a)中获得的植物基因编辑载体转入农杆菌；c)用所述农杆菌侵染番茄外植体，然后置于共培养基上进行共培养；d)将外植体置于恢复培养基上进行恢复培养；e)在恢复培养基上进行恢复培养后，将外植体置于筛选培养基上进行筛选培养；f)将筛选获得的抗性苗转入生根培养基进行生根培养，直至产生完整的植株，其中，步骤d)的恢复培养和步骤e)的筛选培养中的至少一个包括在高温培养温度例如30℃-34℃下进行培养。在一个优选的实施方案中，在所述筛选培养期间更换2-3次培养基。在一个进一步优选的实施方案中，在高温培养温度下进行的恢复培养的时间为恢复培养的第1、2、3、4、或5天。在另一个进一步优选的实施方案中，在高温培养温度下进行的筛选培养的时间为筛选培养的第1、2、3、4、5、6或7天。在一个进一步优选的实施方案中，在所述由CRISPR/Cas9介导的植物基因编辑载体中，用番茄内源的U6启动子驱动sgRNA表达。在另一个进一步优选的实施方案中，在所述由CRISPR/Cas9介导的植物基因编辑载体中，用番茄EF启动子驱动Cas9表达。在一个进一步优选的实施方案中，所述番茄U6启动子的序列如SEQIDNO:9所示。在另一个进一步优选的实施方案中，所述sgRNA的序列如SEQIDNO:5所示。在一个进一步优选的实施方案中，所述番茄EF启动子的序列如SEQIDNO:10所示。在另一个进一步优选的实施方案中，所述Cas9的序列如SEQIDNO:2所示。在一个进一步优选的实施方案中，使用壮观霉素抗性基因作为筛选标记基因来进行筛选。在一个进一步优选的实施方案中，所述壮观霉素抗性基因的序列如SEQIDNO:7所示。专利技术描述为了验证番茄内源启动子驱动Cas9和sgRNA可以提高基因编辑的效率，本文以番茄的一个内源基因(SlMYB12)为目标基因，分别比较了番茄的EF启动子和拟南芥EF启动子驱动Cas9的基因编辑效率，以及番茄内源U6启动子和拟南芥U6启动子驱动sgRNA的基因编辑效率。结果显示，番茄内源的启动子驱动Cas9或sgRNA都可以大大提高番茄基因编辑的效率。同时本实验对转化过程中恢复阶段和筛选阶段的外植体进行了24小时不同温度的处理，实验发现提高温度可以显著提高基因编辑的效率。这为今后在植物中改造基因编辑系统提供了很好的理论依据。附图说明图1.不同启动子驱动Cas9或者sgRNA的载体示意图。图2.在高温下CRISPR/Cas9产生的突变类型的统计。图3.突变体对应的基因型。图4.突变表型示例。序列表信息SEQIDNO:1为prAtEF(拟南芥EF启动子序列)。SEQIDNO:2为cCas9(Cas9基因序列)。SEQIDNO:3为tNos(Nos终止子序列)。SEQIDNO:4为prAtU6(拟南芥U6启动子序列)。SEQIDNO:5为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用CRISPR‑Cas9在番茄中进行基因编辑的方法，其特征在于，所述的方法包括下列步骤：a)构建由CRISPR‑Cas9介导的植物基因编辑载体；b)将在步骤a)中获得的植物基因编辑载体转入农杆菌；c)用所述农杆菌侵染番茄外植体，然后置于共培养基上进行共培养；d)将外植体置于恢复培养基上进行恢复培养；e)在恢复培养基上进行恢复培养后，将外植体置于筛选培养基上进行筛选培养；f)将筛选获得的抗性苗转入生根培养基进行生根培养，直至产生完整的植株，其中，步骤d)的恢复培养和步骤e)的筛选培养中的至少一个包括在高温培养温度例如30℃‑34℃下进行培养。

【技术特征摘要】
1.一种用CRISPR-Cas9在番茄中进行基因编辑的方法，其特征在于，所述的方法包括下列步骤：a)构建由CRISPR-Cas9介导的植物基因编辑载体；b)将在步骤a)中获得的植物基因编辑载体转入农杆菌；c)用所述农杆菌侵染番茄外植体，然后置于共培养基上进行共培养；d)将外植体置于恢复培养基上进行恢复培养；e)在恢复培养基上进行恢复培养后，将外植体置于筛选培养基上进行筛选培养；f)将筛选获得的抗性苗转入生根培养基进行生根培养，直至产生完整的植株，其中，步骤d)的恢复培养和步骤e)的筛选培养中的至少一个包括在高温培养温度例如30℃-34℃下进行培养。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述筛选培养期间更换2-3次培养基。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在高温培养温度下进行的恢复培养的时间为恢复培养的第1、2、3、4、或5天。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在高温培养温度下进行的筛选培养的时间为筛选培养的第1、2、3、4、5、...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘春霞，桂花萍，文琴，刘宇博，李超，许建平，
申请(专利权)人：先正达作物保护股份公司，先正达生物科技中国有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH