一种β-甘露糖苷酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种β‑甘露糖苷酶及其应用。本发明专利技术的β‑甘露糖苷酶的多肽的序列为：(1a)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；或者(2a)与SEQ ID NO：1具有至少75％序列同一性且具有与SEQ ID NO：1相同功能的β‑甘露糖苷酶的氨基酸序列。本发明专利技术还公开一种β‑甘露糖苷酶的表达载体及宿主细胞。本发明专利技术公开的β‑甘露糖苷酶在pH 3.5‑8以及温度30‑65℃具有较好的甘露糖苷酶酶活稳定性。将本发明专利技术的β‑甘露糖苷酶用于生产甘露糖时，甘露糖的产量能够达到7.1mg/mL，是不添加本发明专利技术β‑甘露糖苷酶的约6倍，具有潜在的工业应用价值。

A beta-mannosidase and its application

The invention discloses a beta mannosidase and its application. The sequence of the polypeptide of the beta mannosidase of the present invention is: (1) an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO:1; or (2 a) an amino acid sequence of the beta mannosidase with at least 75% sequence identity and the same function as SEQ ID NO:1. The invention also discloses an expression vector of beta mannosidase and a host cell. The beta mannosidase disclosed by the invention has good stability of mannosidase activity at pH 3.5 8 and temperature 30 65 C. When the beta mannosidase of the invention is used to produce mannose, the yield of mannose can reach 7.1 mg/mL, which is about 6 times as high as that without adding the beta mannosidase of the invention, and has potential industrial application value.

【技术实现步骤摘要】
一种β-甘露糖苷酶及其应用
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种β-甘露糖苷酶及其应用。
技术介绍
β-甘露糖苷酶(EC3.2.1.25)属于半纤维素酶系的一种外切酶，它能催化水解1，4-β-D糖苷酶，在非还原端切下甘露糖，在食品、制药、石油和生物转化等行业有广泛的应用(McclearyBV，NurthenE，TaravelFR，etal.Characterisationofoligosaccharidesproducedonhydrolysisofgalactomannanwithβ-D-mannanase[J].CarbohydrateResearch，1983，118(JUL)：91-109)尤其可以替代化学法生产甘露糖。甘露糖溶解性好，不易结晶，在食品和制药行业中具有潜在的应用价值。β-甘露糖苷酶另一个应用是利用它的转糖苷能力合成甘露寡糖，以替代化学方法生产功能性甘露寡糖(TaubkenN，ThiemJ.EnzymaticSynthesisofAlkylandHydroxyalkylβ-D-Mannopyranosides[J].Synthesis，1992，1992(6)：517-518.)，甘露寡糖不仅能增强动物的免疫能力，降低胃肠道疾病的发生率和动物的死亡率，而且还能提高动物的日增重和饲料转化率(岳文斌，车向荣，减建军，等.甘露寡糖对断奶仔猪肠道主要菌群和免疫机能的影响[J].山西农业大学学报(自然科学版)，2002，22(2)：97-101)。因此，对β-甘露糖苷酶的开发具有重要的工业化应用前景。国外己有少数微生物来源β-甘露糖苷酶基因克隆和表达的报道(ChauhanPS，GuptaN.Insightintomicrobialmannosidases：areview[J].CriticalReviewsinBiotechnology，2016，8：1-12.)，但文献中报道的大多数β-甘露糖苷酶的分子量较大，在90～130KDa，难于表达，限制了β-甘露糖苷酶的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种β-甘露糖苷酶的多肽、其编码基因、表达该β-甘露糖苷酶的多肽的菌株、宿主细胞及表达载体，并提供一种β-甘露糖苷酶的应用。为实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案为：一种β-甘露糖苷酶的多肽，所述β-甘露糖苷酶的多肽的序列为：(1a)如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列；或者(2a)与SEQIDNO：1具有至少75％序列同一性且与SEQIDNO：1具有相同的β-甘露糖苷酶功能的氨基酸序列。本专利技术提供了上述β-甘露糖苷酶的多肽的编码基因，所述新型β-甘露糖苷酶多肽的编码基因由以下序列组成：(1b)SEQIDNO：2所示的核苷酸序列；或者(2b)与SEQIDNO：2具有至少75％序列同一性且与SEQIDNO：2具有相同的β-甘露糖苷酶功能的核苷酸序列。本专利技术涉及的β-甘露糖苷酶的编码基因来源于自行筛选的多枝横梗霉(Lichtheimiaramose)，与基因数据库中公开的β-甘露糖苷酶基因的相似性较低，是一种新型糖基水解酶5家族β-甘露糖苷酶，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，该β-甘露糖苷酶由444个氨基酸组成，相对分子量约60kDa，与传统的β-甘露糖苷酶相比易于表达。本专利技术的β-甘露糖苷酶多肽还可为含有与SEQIDNO：1具有由BLAST算法所测定的至少75％(如80％，90％，95％或99％)氨基酸相似性的序列，且该多肽具有β-甘露糖苷酶活性。与该β-甘露糖苷酶氨基酸同源性最高的是LichtheimiacorymbiferaJMRC：FSU：9682glycosidehydrolasefamily5protein(序列号：CDH53051.1)两者的一致性为305/408(75％)；其次是RhizomucorMiehei米黑根毛霉mannosidase(序列号：AGV01048.1)两者的一致性为312/425(73％)。本专利技术还提供了一种表达载体，本专利技术的表达载体由上述β-甘露糖苷酶的编码基因和基础载体组成。优选地，所述基础载体为毕赤酵母表达载体。优选地，所述基础表达载体为pPIC9、pPIC9k或pHIL-S1、pPICZαA、pYAM75P中的一种。更优选地，所述毕赤酵母表达载体为pPICZαA。本专利技术提供了一种β-甘露糖苷酶基因表达盒，所述基因表达盒的表达元件包括启动子，上述的编码基因以及终止子。优选地，所述基因表达盒的表达元件从5’到3’依次为AOX1启动子，促进β-甘露糖苷酶分泌的信号肽，β-甘露糖苷酶的编码基因，以及AOX1终止子。其中β-甘露糖苷酶的编码基因序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术提供了一种基因工程化的宿主细胞，所述宿主细胞包含表达载体或者基因表达盒。优选地，所述宿主细胞为甲醇营养型酵母菌宿主细胞。更优选地，所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母。本专利技术提供了所述多肽、所述编码基因、所述表达载体、所述基因表达盒，所述宿主细胞在制备β-甘露糖苷酶中的应用。本专利技术提供了一种β-甘露糖苷酶在生产甘露糖方面的应用。优选地，所述β-甘露糖苷酶在生产甘露糖方面的应用为β-甘露糖苷酶在酶解刺槐豆胶生产甘露糖方面的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术提供了一种β-甘露糖苷酶多肽及其编码基因，该β-甘露糖苷酶多肽具有由BLAST算法所测定的至少75％(如80％，90％，95％或99％)氨基酸相似性的序列，且该多肽具有β-甘露糖苷酶活性。(2)使用本专利技术的β-甘露糖苷酶基因所表达的β-甘露糖苷酶，当将其用于生产甘露糖时，甘露糖的产量能够达到7.1mg/mL，是不添加本专利技术β-甘露糖苷酶的约6倍，具有潜在的工业应用价值。附图说明图1是pPICZαA-LrMan5表达载体示意图；图2是实施例2中的菌落PCR图；图3是β-甘露糖苷酶LrMan5的SDS-PAGE图；图4是pH对LrMan5酶活力影响结果图；图5是温度对LrMan5酶活力影响结果图；图6是LrMan5的pH稳定性结果图；图7是LrMan5的温度稳定性结果图；图8是LrMan5的动力学常数分析图；图9是LrMan5与甘露聚糖协同降解刺槐豆胶生产甘露糖的HPLC图。具体实施方式为更好地说明本专利技术的目的、技术方案和有益效果，下面将结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明。需说明的是，下述实施所述方法是对本专利技术做的进一步解释说明，不应当作为对本专利技术的限制。本专利技术的实施例中所用的材料、试剂若无特殊说明皆可从商业途径获得。实施例1β-甘露糖苷酶LrMan5基因的克隆提取Lichtheimiaramose的基因组DNA，以基因组DNA为模板，设计引物LrMan5-F/R，序列如表1所示(SEQID：3/SEQID：4)，通过常规PCR的方法获得β-甘露糖苷酶(LrMan5)的基因，基因序列如SEQIDNO：1所示。表1：LrMan5扩增引物序列获得LrMan5基因的PCR反应体系如表2所示，反应条件如表3所示。表2：PCR反应体系表3：PCR反应条件实施例2包含LrMan5编码基因的毕赤酵母表达载体构建与验证(1)LrMan5基因与质粒pPICZαA分别双酶切LrMan5基因双酶切反应体系如表4所示，质粒pP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种β‑甘露糖苷酶的多肽，其特征在于，所述β‑甘露糖苷酶的多肽的序列为：(1a)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；或者(2a)与SEQ ID NO：1具有至少75％序列同一性且与SEQ ID NO：1具有相同的β‑甘露糖苷酶功能的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种β-甘露糖苷酶的多肽，其特征在于，所述β-甘露糖苷酶的多肽的序列为：(1a)如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列；或者(2a)与SEQIDNO：1具有至少75％序列同一性且与SEQIDNO：1具有相同的β-甘露糖苷酶功能的氨基酸序列。2.一种β-甘露糖苷酶的编码基因，其特征在于，所述β-甘露糖苷酶的编基因的核苷酸序列为：(1b)SEQIDNO：2所示的核苷酸序列；或者(2b)与SEQIDNO：2具有至少75％序列同一性且与SEQIDNO：2具有相同的β-甘露糖苷酶功能的核苷酸序列。3.一种表达载体，其特征在于：所述表达载体由权利要求2所述的编码基因和基础载体组成；优选地，所述基础载体为毕赤酵母表达载体。4.一种β-甘露糖苷酶基因表达盒，其特征在于：所述基因表达盒的表达元件包括启动子，权利要求2所述的编码基因以及终止子。5.一种基因工程化的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：王耀辉，谢敏，谢建华，何志梅，徐莉敏，王铮，
申请(专利权)人：东莞泛亚太生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44