一种催化效率提高的木聚糖酶突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种催化效率提高的木聚糖酶突变体，属于基因工程和蛋白质表达技术领域。本发明专利技术通过定点突变和饱和突变生物技术改造木聚糖酶的分子结构，得到一株催化活性提高的木聚糖酶突变体AEx11A

A Xylanase Mutant with Enhanced Catalytic Efficiency

The invention discloses a xylanase mutant with improved catalytic efficiency, which belongs to the field of genetic engineering and protein expression technology. The present invention modifies the molecular structure of xylanase by site mutation and saturation mutation biotechnology, and obtains a xylanase mutant AEx11A with enhanced catalytic activity.

【技术实现步骤摘要】
一种催化效率提高的木聚糖酶突变体
本专利技术涉及一种催化效率提高的木聚糖酶突变体，属于基因工程和蛋白质表达

技术介绍
木聚糖(xylan)是半纤维素的重要组成成分，是一种重要的可再生生物资源。内切β-1,4-木聚糖酶简称为木聚糖酶(xylanases,EC3.2.1.8)，能够水解木聚糖分子主链内部的β-1,4-糖苷键，广泛应用于食品、造纸和饲料等领域。不同来源的木聚糖酶酶学性质各有不同，研究发现天然存在的木聚糖酶极少可以兼具高活性和高耐热性。因此，越来越多的研究者对木聚糖酶进行分子改造以期获得酶学性质优良的工业化木聚糖酶。目前对于木聚糖酶的分子改造研究主要集中在对酶的耐热性改造方面。然而，大多数改造后的木聚糖酶在耐热性提高的同时伴随着活性的下降，这在一定程度上限制了耐热木聚糖酶在工业中的应用。因此，一些研究者开始以耐热性较高的天然木聚糖酶为出发菌株，通过基因突变来提高其酶活性，以期获得耐热性和活性俱佳的突变木聚糖酶。如罗建杰等利用PCR方法将木聚糖酶XYN-W的C端57个氨基酸序列去除，比活性提高了43.9％；王谦等对木聚糖酶ATX活性位点附近的单一氨基酸实施定点突变(L49P)来增强木聚糖酶的活性，Kcat/Km值较原酶提高了51.7％。虽然很多研究者通过基因突变技术对木聚糖酶进行了分子改造并取得了一定的成果，但仍未能达到工业化应用的水平，改善木聚糖酶催化特性的分子改造研究还有待进行。
技术实现思路
本专利技术通过构建突变文库结合定点突变，筛选获得了催化活性提高的木聚糖酶。本专利技术的目的是提供一种催化效率提高的AEx11A突变体，所述突变体的氨基酸序列是SEQIDNO.1所示的序列。本专利技术的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术的第三个目的是提供携带所述基因的载体或表达所述突变体的细胞。本专利技术的第四个目的是提供一种提高木聚糖酶催化活性的方法，所述方法是在突变体如序列SEQIDNO.2所示的氨基酸的基础上，将第98位的苏氨酸突变成天冬氨酸(T98D)，和/或将第124位的缬氨酸突变成谷氨酰胺(V124Q)。在本专利技术的一种实施方式中，编码SEQIDNO.2所示的木聚糖酶的基因序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术的第五个目的提供一种基因工程菌，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主，表达了SEQIDNO.1所示的木聚糖酶突变体在本专利技术的一种实施方式中，表达载体是以下任意一种：pET-22b(+)、pET-28a(+)、pET-32a(+)、pET-41a(+)。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体是pET-28a(+)。在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌宿主菌是以下任意一种：E.coliBL21、E.coliJM109、E.coliDH5α或E.coliTOP10。在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌宿主菌是E.coliBL21。本专利技术的第六个目的是提供一种组合物，含有SEQIDNO,1所示的木聚糖酶突变体，或表达所述突变体的基因工程菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述组合物是菌剂，含有表达SEQIDNO,1所示木聚糖酶突变体的细胞和细胞保护剂。本专利技术还要求保护所述木聚糖酶突变体或所述基因工程菌在生产食品、饲料或造纸方面的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术在具有一定催化活性的木聚糖酶基础上，通过定点突变生物技术改造木聚糖酶的分子结构，得到一株催化活性提高的木聚糖酶突变体AEx11AT98D/V124Q。突变酶的比活性及催化效率分别为AEx11A的3.04和2.74倍，而且该酶的最适温度为75℃，在该温度下的半衰期为188分钟，均与原酶类似。这说明该突变酶不但酶活和动力学参数提高了，而且保持了其在耐高温和高热稳定性方面的性质。本专利技术解决了木聚糖酶催化活性低的限制性问题，有较大应用潜力，也为木聚糖酶的研究奠定了理论基础。附图说明图1为不同温度下酶的相对活性。图2为酶的温度稳定性示意图。具体实施方式木聚糖酶的活性测定方法：向两个25mL具塞试管A和B中各加入2.4mL0.5％桦木木聚糖溶液(pH5.5、50mmol/L柠檬酸-Na2HPO4缓冲液配制)，先50℃预热10min，向A管中加入0.1mL适当稀释的酶液，50℃准确反应15min；立即各加入2.4mL3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂，向B管中再补加0.1mL灭活的酶液，A、B管沸水浴显色7min；冷却后各加去离子水5mL，摇匀；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从木糖标准曲线上查出相应的还原糖(以木糖计)含量并折算成酶活性单位。在上述反应条件下，1个木聚糖酶活性单位(U)定义为每分钟产生1μmol还原糖(以D-木糖计)所需的酶量。实施例1突变文库的构建通过搜索蛋白质PDB数据库，获得与木聚糖酶AEx11A的蛋白质序列一致性为76％的木聚糖酶晶体结构(PDB:2VGD)，以2VGD为模板，利用SWISS-MODEL对木聚糖酶AEx11A进行三维结构模拟，对模拟后的AEx11A进行分子对接。通过对AEx11A的三维结构进行保守性分析和氨基酸位置及理化性质分析，选择同时将第98位的苏氨酸突变成了天冬氨酸，并在上述基础上对第124位的缬氨酸进行饱和突变，筛选出最优转化子。基于以上设计的突变位点，设计并合成特异性定点突变引物为T98D-F、T7-R(如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示)和饱和定点突变引物V124X-F(如SEQIDNO.7所示)、T7-R(如SEQIDNO.6所示)。以携带AEx11A基因的重组质粒pET-28a(+)-AEx11A为模板，T98D-F、T7-R为上下游引物，进行突变PCR，即得到编码的第98位氨基酸由苏氨酸突变成了天冬氨酸的重组质粒pET-28a(+)-AEx11AT98D；以pET-28a(+)-AEx11AT98D为模板，V124X-F、T7-R为上下游引物，进行定点饱和突变PCR，构建饱和突变文库pET-28a-AEx11AT98D/V124X(X代表任意氨基酸)。实施例2：突变文库的筛选将实施例1构建的饱和突变文库pET-28a-AEx11AT98D/V124X转化E.coliBL21感受态细胞，具体方法如下：1)接种LB平板活化的E.coliBL21于2mLLB培养基中，37℃，220r/min过夜培养；2％接种上述培养液于5mLLB培养基中，37℃，220r/min培养4h；2)取上述菌液1.4mL放入1.5mLEP管中，冰浴10min，4000r/min离心2min，收集菌体；3)加入1mL预冷的0.1MCaCl2溶液重悬上述细胞，冰浴10min，4000r/min，离心2min，收集菌体；4)加入100μL预冷的0.1MCaCl2溶液悬浮上述细胞，4℃保存30min即可转化；5)取100μL感受态细胞于冰上完全解冻后，轻轻将细胞均匀悬浮，加入5μL连接液，轻轻混匀，冰上放置30min；6)42℃水浴热激90s，冰浴15-20min；7)加入400μLLB培养基，37℃，220r/min振荡培养1h；8)室温下4000r/min离心5min，去掉450μL上清液，将剩余菌液吹打混匀后，涂布于Kan板上；9)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，含有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述木聚糖酶突变体的基因。3.携带权利要求2所述基因的载体。4.表达权利要求1所述木聚糖酶突变体的细胞，其特征在于，包括真菌细胞或细菌细胞。5.一种基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达了权利要求1所述的木聚糖酶突变体。6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主包括以下任意一种：E.coliBL21、E.coliJM109、E.coliDH5α...

【专利技术属性】
技术研发人员：张婷，胡博醇，苏永君，文正，徐雄峰，刘艳，胡蝶，李剑芳，邬敏辰，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32