本发明专利技术公开了一种根瘤菌JYN6及其应用，属于微生物技术领域。该菌株是从决明属牧草新鲜根瘤中分离和纯化，PCR检测nodA gene，并经16S rDNA分子生物学鉴定所得，确定为慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）的新菌株系，并命名为安羽1号。于2018年4月10日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018192。本发明专利技术的根瘤菌JYN6通过实验室盆栽回接试验证明其具有高效结瘤和固氮能力强的特性，接种该根瘤菌能够显著提高决明属牧草的根瘤数、根瘤固氮效率、生物量和植株氮含量，进而达到培肥地力和改善生态环境的效果。
A Rhizobium JYN6 of Cassia and Its Application
The invention discloses a Rhizobium JYN6 and its application, belonging to the field of microbial technology. The strain was isolated and purified from fresh nodules of Cassia. The nodA gene was detected by PCR and identified by 16S rDNA molecular biology. It was identified as a new strain of Bradyrhizobium and named Anyu 1. On April 10, 2018, it was preserved in the China Typical Culture Preservation Center with the number CCTCC NO: M2018192. The Rhizobium JYN6 of the invention has the characteristics of high nodulation efficiency and strong nitrogen fixation ability through pot experiment in laboratory. The inoculation of the Rhizobium can significantly improve the nodule number, nodule nitrogen fixation efficiency, biomass and plant nitrogen content of Cassia forage, thereby achieving the effect of fertilizing the soil and improving the ecological environment.
【技术实现步骤摘要】
一株决明属根瘤菌JYN6及其应用
本专利技术属于微生物领域，具体涉及一株决明属根瘤菌JYN6及其应用。
技术介绍
我国约有5690万hm2酸性土壤，占总耕地面积42.2%以上。近年来，随着大量化学氮肥的施用，土壤酸化日趋严重。我国酸性土壤主要集中在长江以南地区，该地区光、热、水等资源丰富，但土壤瘦瘠、粘重、pH值低及养分有效性低，严重制约了该地区农业的快速发展。在生产上，往往通过施用大量化肥来提高作物产量。但是大量化肥的投入不仅会导致土壤板结及进一步酸化，而且还会造成水体富营养化和地下水的污染，严重破坏生态环境。通过种植豆科植物结合根瘤菌接种技术，来改良土壤、提高土壤肥力是目前较为认可的一种途径。豆科植物能与根瘤菌结合形成互利互惠的共生关系。根瘤菌从宿主植物得到生长所需的碳水化合物及其他养分，而宿主植物则从根瘤菌生物固氮过程中获取氮素营养，以达到提高农作物产量和降低化肥使用量的效果，进而在减少水土污染的同时保持农业的可持续发展。决明属植物(Chamaecristaspp.Greene.)是热带、亚热带地区重要的豆科植物，包括乔木、灌木和草本等三类。圆叶决明(Chamaecristarotundifolia(Pers.)Greene)原产于澳大利亚，是决明属半直立型多年生豆科草本植物，具有固氮效率高、耐贫瘠、生物量较大、花色艳丽，特别适应酸性土壤等特性。1996年，福建省农业科学院从澳大利亚牧草种质资源中心引进圆叶决明，并将其作为改良酸性土壤的豆科绿肥型牧草，在福建、广东和广西等酸性土壤地区推广种植。但是，圆叶决明在自然条件下结瘤慢且少、固氮效率较低，严重影响其种植及推广应用。因此，为提高圆叶决明的结瘤率和固氮效率，急需筛选出结瘤率高和固氮能力强的根瘤菌菌株，以提高决明属牧草的固氮效率，进而达到培肥地力和改善生态环境的效果。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一株决明属根瘤菌JYN6，该菌株的分类命名为根瘤菌（Bradyrhizobiumsp.）JYN6，是慢生根瘤菌属的新菌株系，于2018年4月10日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2018192，保藏地址为：武汉大学。该菌株具有结瘤率高和固氮能力强的特点。本专利技术的另一个目的是将上述根瘤菌JYN6应用在豆科决明属植物共生固氮中，通过提高圆叶决明的生物固氮能力，促进其生长，达到决明生产中减肥增效的目的。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案来实现的：1根瘤菌菌株的分离和纯化1）取羽叶决明新鲜、成熟且个大饱满的根瘤，用水冲洗干净，并用滤纸吸干表面水分；2）放入95%（w/v）的酒精中处理3~5分钟，再放入0.1%（w/v）HgCl2中，灭菌3~5分钟，取出后用无菌水冲洗5~6次；3）在火焰灭菌的载玻片上切成两半，用无菌镊子夹住半个瘤，切口面向YMA培养基表面划线，倒置后在28℃下培养。YMA培养基的配方如表1所示：表1YMA（YeastMannitolAgar）培养基配方4）待长出菌体后，用枪头从平板上刮取少量根瘤菌菌落，加1mL无菌水稀释后再次于平板上划线培养，3d之后观察菌落情况，一直观察到15d(慢生根瘤菌需7~15d出现菌落)。如无单克隆菌落出现，则需反复在平板上划线纯化，直到出现单克隆菌落。5）待长出单克隆菌体后，根据以下两个方面判断其是否为根瘤菌：①菌落形态：根瘤菌的菌落为圆形、乳白色、半透明、边缘整齐、粘质或多或少。培养3~5d菌落直径达2~4mm为快生型根瘤菌，培养7~10d菌落直径为1mm则为慢生型根瘤菌。②nodAgene的PCR检测：挑取上述形态根瘤菌单克隆进行nodAgenePCR检测，引物分别为nodA-F和nodA-R，正向引物SEQIDNO.1：nodA-F5’-TGCRGTGGARDCTRYGCTGGGAAA-3’；反向引物SEQIDNO.2：nodA-R5’-GNCCGTCRTCRAASGTCARGTA-3’。酶选用2×starMix，分别用根瘤菌BXYD3的基因组DNA和水为模板做阳性对照及阴性对照。nodAgene长度为666bp，运用电泳成像技术观察其在666bp处是否具有条带，具有条带的菌落为根瘤菌。其PCR反应体系如表2：表2nodAgene2×starMix酶反应体系反应条件：94℃5min；（94℃30s，55℃30s，72℃1min）×35cycle；70℃5min。2根瘤菌JYN6的性质1)形态特征该菌株在菌落形态上，为慢生型，圆形较小、乳白色、半透明、粘质较多。在YMA平板上生长5~7d后的直径为0.8~2.0mm(附图1)。2)培养特性该菌的最适生长条件为：pH＝7.0，温度28℃，转速180r/min，可利用甘露醇和酵母粉分别作为其碳源和氮源。3)基因特性经nodAgenePCR、电泳成像检测，在666bp处具有较亮条带(附图2)。4)功能特性根瘤菌JYN6具有结瘤率高和固氮能力强等特点。菌体被释放到自然环境中，对人、动物和植物无害，不会污染环境，反而丰富了土壤间根瘤菌的群体多样性，对决明属牧草的结瘤固氮具有明显的促进作用。根瘤菌JYN6的16SrDNA分子生物学鉴定为鉴定根瘤菌菌株的系统发育地位，对所分离到的根瘤菌进行16SrDNA的PCR特异性扩增，测序正向引物SEQIDNO.3：V4V5515-F5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’；测序反向引物SEQIDNO.4：V4V5907-R5’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’；测序所得根瘤菌JYN6的16SrDNA序列如SEQIDNO.5所示；其PCR反应体系如表3：表316SrDNA2×starMix酶反应体系反应条件：95℃5min；（95℃20s，55℃20s，72℃50s）×44cycle；70℃5min。从NCBI(GenBank)数据库中获取13个参比菌株序列，运用软件BioEdit和MEGA6对分离菌株和参比菌株的16SrDNA部分序列进行分析，构建分离菌株与参比菌株的系统发育树。从而确定根瘤菌JYN6为慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)的新菌株系(附图3)，并命名为安羽1号。本专利技术具有如下有益效果：1)本专利技术的根瘤菌JYN6具有结瘤率高和固氮能力强的特性。回接试验发现，与不接种根瘤菌相比，接种该根瘤菌30d分别提高圆叶决明鲜重和干重161.78wt%和213.49wt%，可用于实际生产；2)圆叶决明接种本专利技术的根瘤菌JYN6，极显著地提高了植株全氮含量(P<0.01)，从而达到促进圆叶决明植株生长和培肥地力的目的；3)本专利技术的根瘤菌JYN6适用于南方酸性土壤地区，能作为圆叶决明常规栽培的重要措施之一。附图说明图1根瘤菌JYN6在YMA培养基上的菌落形态；图2根瘤菌JYN6经nodAgenePCR、电泳成像检测所成图像；其中，+代表用根瘤菌BXYD3的DNA做阳性对照，-表示用水做阴性对照。图3根瘤菌JYN6的16SrDNA部分序列分析系统发育树；其中，分支上的数字表示可信度；括号内容表示在Genebank中的登录号；比例尺表示100个核苷酸里有2个替换。图4根瘤菌JYN6蛭石回接效果图；CK：空白对照。图5接种根瘤菌JYN630d后圆叶决明结瘤数及根瘤本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株决明属根瘤菌 JYN6，其特征在于：所述根瘤菌（Bradyrhizobiumsp.）JYN6，是从决明属牧草新鲜根瘤中分离和纯化，PCR 检测 nodA gene，并经16S rDNA 分子生物学鉴定所得，于 2018 年 4 月10 日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO：M2018192。
【技术特征摘要】
1.一株决明属根瘤菌JYN6，其特征在于：所述根瘤菌（Bradyrhizobiumsp.）JYN6，是从决明属牧草新鲜根瘤中分离和纯化，PCR检测nodAgene，并经16SrDNA分子生物学鉴定所得，于2018年4月10日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2018192。2.根据权利要求1所述的一株决明属根瘤菌JYN6，其特征在于：所述PCR检测nodAgene的引物序列...
【专利技术属性】
技术研发人员：廖红，杨庆，李欣欣，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建,35
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