一种制造苜蓿根瘤菌剂的方法、由该方法制得的菌剂及其应用技术

本发明专利技术提供了一种制造苜蓿根瘤菌剂的方法、由该方法制得的菌剂及其应用。本发明专利技术的所述方法包括如下步骤：S1：获得苜蓿根瘤菌的菌液；S2：获得包含高岭土粉末和膨润土粉末的粉剂，所述高岭土粉末和所述膨润土粉末的粒度20微米至100微米；S3：将所述菌液与所述粉剂混合、干燥并粉碎，从而获得所述粉剂吸附有苜蓿根瘤菌的所述菌剂。本发明专利技术所述的苜蓿根瘤菌剂具有有效活菌数高、保存期长、环境友好、适合于商品化和工业化生产等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于农业微生物
，具体的说，本专利技术涉及一种高稳定性的苜蓿根 瘤菌剂及其制造方法和应用。
技术介绍
根瘤菌能与豆科植物形成共生固氮体已是一个不争的话题，但什么样的根瘤菌能 与豆科植物形成共生体则随着根瘤菌范围的扩大及根瘤菌多样性的增加而变得日益复杂。 豆科牧草能与根瘤菌共生固氮，只有土壤中存在某一豆科牧草所专有的细菌并达一定数量 时，这种根瘤才能形成。这种能使豆科牧草根上形成根瘤的细菌，称为根瘤菌。根瘤菌能从 空气中固定游离的氮，转变成豆科牧草便于吸收利用的含氮化合物，供豆科牧草生长之需。 对于豆科牧草来说，与根瘤菌的共生固氮作用，是增加草产量、节省氮肥用量的有利特性。 而根瘤菌的有无与多少、固氮率的高低，会直接影响草产量的多少。因此在未种植过相应种 类的豆科牧草的地区，接种根瘤菌与否是种植豆科牧草成功的关键。即使是种植过豆科牧 草的地区，接种高效的根瘤菌种，也是增加草产量的有效措施。因此，在播种前对豆科牧草 种子进行根瘤菌接种，能提高牧草产量和品质。 目前我国农牧业生产中每年施用的化肥氮量已达2400多万吨，占我国化肥养分施 用总量的60%左右，占世界氮肥总施用量的30%左右，居世界之首。施用氮肥对我国农业生 产的发展起到了十分重要的作用。但是，近年来我国氮肥施用的增产效果趋于降低，而环 境污染则趋于加重，引起了国内外的广泛关注。 在缺氮土壤中，接种根瘤菌的豆科植物其氮素营养约有2/3来自共生固氮，仅有1/ 3是从土壤中吸收来的。豆科植物如果接种适合的根瘤菌，每个生长季节每公顷可固氮 150kg~200kg甚至更多，接种根瘤菌除能改善豆科植物本身的生长外，还可以为与其共生 的非豆科植物提供氮素营养，因此豆科植物接种根瘤菌可以减少氮肥的大量使用，既能减 少化学氮肥用量，又能减轻大量使用化学氮肥所造成的土壤结构破坏和地下水污染。因此， 豆科植物接种根瘤菌对减少氮肥的投入成本，提高肥料利用率，改善植物生长具有重要意 义，也是防止水土流失，改善生态环境的一个重要措施。 近十年来，我国豆科植物接种根瘤菌的面积并没有进一步增加。据估计，接种根瘤 菌的仅占豆科植物总播种面积的2~3%，与国外30~50%的接种率相比差距很大，其主要 原因是我国生产的根瘤菌剂质量不高。在美国有80%的紫花苜蓿在种植前需要进行根瘤菌 接种。接种根瘤菌能提早紫花苜蓿结瘤、提高紫花苜蓿的产量和品质，还能起到增加土壤有 机质含量，改良土壤结构和提高土壤肥力等作用。国内根瘤菌剂的应用效果均表明，接种根 瘤菌剂能使紫花苜蓿干草产量提高37 %以上，结瘤量提高70 %。 根瘤菌的特异性很强，不同种族具有专一性。某一族的根瘤菌只能对本族的几个 豆科属、种有效，并可以相互接种，而对不同族的豆科植物则表现无效。如苜蓿根瘤菌对三 叶草则不起作用，不能形成根瘤。因此对于不同种豆科牧草需选用其专有的根瘤菌接种才 能发挥作用。根据牧草和根瘤菌的特异性关系，可将根瘤菌分为3类： (1)高度特异型：必须要专性根瘤菌接种，这些根瘤菌包括三叶草族、菜豆族、大 豆族等，分别只侵染本属植物或其属内的若干种。 (2)特异型：必须用专性根瘤菌接种，但这些根瘤菌不但可侵染本属，而且可以接 种于近缘属种，这类根瘤菌包括苜蓿族、豌豆族、羽扇豆族等，如苜蓿族可接种于苜蓿属 (Medicago)、草木樨属(Melilotus)和胡卢巴属（Trigonellea)。豌豆族可接种于豌豆属 (卩1811111)、巢菜属(>；^11：1171'118)和兵豆属(1^118)。羽扇豆族可接种于羽扇豆 属(Lupinus)和乌足豆属(Ornithopus)。 (3)非特异型：其根瘤菌能侵染的植物属种很多。如豇豆族可接种于豇豆属 (Vigan)、胡枝子属(Lenspedeza)、花生属(Arachis)、木兰属（Indigofera)等 10多个属。 与本专利技术相关的现有技术的技术方案及工艺流程可以参见图1。现有技术方案可 以大致分为如下三种方案。 ( - )方案一 (1)培养基的成分甘露醇l〇g或甘油5mL+鹿糖5g，K2HP〇4〇·5g，MgS〇4〇·2g，NaC10·lg，酵母膏lg，〇&0)30.28,0.5%硼酸溶液411^，0.5%钼酸钠41^，琼脂18~2(^，？!1值为7~7.2.压力灭菌 30s，培养温度28~30°C。 (2)摇瓶培养 每升培养基加水500mL，在28~30°C温度条件下培养，转速为20转/分钟。菌种按 10%的接种量接种并培养在种子罐中，通气0.4~0.8k·m-3 ·S-1，搅拌速度120~200转， 接种24h后，每隔12h取样检查菌数增加情况，菌数可达20~30亿/mL。 (3)发酵罐培养 将种子罐内培养好的菌种接入到发酵罐中，接种量10%~20%，菌数20亿/mL.混 拌吸附将草炭干燥，粉碎过筛.灭菌温度下降到40°C，混拌.菌液:草炭=1/3:4，拌入0.05 % 钼酸铵，搅拌后含水30 %以上。 (4)产品 合格根瘤菌剂细胞>1.4亿，杂菌<10%，有效期在5°C以下，工厂储存6个月，销售 到户时6个月内菌数达到1亿以上. (二)方案二 (1)培养基如下 "标准79"培养基:普通糖10克（加入甘油约2毫升），K2HP〇4 0.5克，MgS〇4 · 7H200.1 克，食盐0.1克，CS〇4〇.2克，酵母片10片，冷开水1000毫升。 (2)操作 1.菌种:取得菌种斜面，移植到上述培养基的试管斜面上，保温培养。一切按无菌 操作进行，种子菌必须纯净。转移接种时最好多刮一些移到新斜面试管。新长起来的菌管斜 面，转移新斜面就比较容易生长，但一般3~5天后才能逐渐看到白色，平滑，边缘齐整，突起 的菌苔。 2.培养:将上述培养液注入小口玻璃瓶中，大约1/4满。其大小以约一立升为好。用 棉花或多层纱布塞满瓶颈和瓶口并用两层纸包扎瓶口，按规定操作高压灭菌半小时。最好 在灭菌后趁温度下降到不烫手时即抢温接种，保温时可把瓶斜卧放以便菌面多接触空气。 接种后1-3天应当将瓶振荡得频繁一些，每天3-5次，每次数分钟，以利好气性的根瘤菌生 长，不利嫌气性的杂菌生长。如果开始1-2天即呈现混浊，有时还有气泡发生，有酸臭，是杂 菌占了上风，培养失败了，应当废弃。如果培养3-5天后液体逐渐由澄倩而混浊这是正常现 象，再坚持人工振摇几天即可移放低温处备用。(三)方案三目前，国内外大都利用自动化发酵技术来获得制备根瘤菌剂所需的高密度细胞培 养液。大致流程为：菌种的斜面活化-一级种子液培养-二级种子液培养-发酵罐内扩大 培养-高密度菌剂的获得。在此期间，发酵培养基种类繁多，有较为常用的以甘露醇-酵母 粉为主的YMA培养基，以豆芽汁为主要成分的BSE培养基，成分较为简单的YA、TY培养基，较 为复杂的AMM、SM培养基，近期诸如以糖废料为底物的一些新型培养基也时有报道，具体采 用何种培养基，还需根据不同菌体的生化特性而定。发酵条件通常为:通气〇 . 4~0.8kg· m3 ·s-S搅拌速度120~200r·π?η-S温度28~30°C，接种量1%~10%，种子液的装液量 20%~60%。放罐时间则根据各种类型根瘤菌的生长状况本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制造苜蓿根瘤菌剂的方法，所述方法包括如下步骤：S1：获得苜蓿根瘤菌的菌液；S2：获得包含高岭土粉末和膨润土粉末的粉剂，所述高岭土粉末和所述膨润土粉末的粒度20微米至100微米；S3：将所述菌液与所述粉剂混合、干燥并粉碎，从而获得所述粉剂吸附有苜蓿根瘤菌的所述菌剂。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王跃栋，王伟，苏爱莲，刘自学，范龙，刘艺杉，侯湃，王圣乾，
申请(专利权)人：北京克劳沃草业技术开发中心，
类型：发明
国别省市：北京;11