本发明专利技术涉及一种重组工程介导的苜蓿中华根瘤菌Rm1021基因敲除方法。具体实施步骤为首先通过重叠－延伸聚合酶链式反应扩增获得两侧为针对待敲除基因的约500bp同源片段、中间为卡那霉素抗性基因的融合DNA片段。其次将此DNA片段电转化至异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组酶表达的Rm1021细胞中，在卡那霉素抗性筛选之下，卡那霉素抗性基因取代目的基因而获得基因敲除变株。最后将菌株在含0.4％蔗糖的固体培养基中培养以消除含重组酶基因的质粒。所使用的重组酶基因来源于λ噬菌体并克隆在质粒pLS2406之上，pLS2406同时含有负筛选标记sacB基因。
【技术实现步骤摘要】
-种重组工程介导的苜蓿中华根瘤菌Rm1021基因敲除方 法
本专利技术涉及基因工程领域，具体是涉及一种重组工程介导的苜蓿中华根瘤菌 Rml021基因敲除方法。
技术介绍
随着现代社会的发展，能源问题成为日益突出的世界性问题，各国对能源的需求 越来越迫切。如何最大效率地获取自然界现存的能源是能源研究和开发领域的关键之一。 氮源是重要的资源，农用饲料和肥料中重要成分为氮的铵盐占据很大的比例。78%的空气 为氮气，而氮气为惰性气体，N-N健高度不活泼，常规的化学反应难以将氮气转化为有效的 铵盐。因此，如能有效地利用空气中的氮资源是获得能源的关键。 固氮微生物是指能够将氮气以化合物的形式固定在与其共生的植物根部并形成 根瘤的一类微生物。根瘤菌是最常见的一种生物固氮菌。根瘤菌和紫花苜蓿共生，通过结 瘤基因的时序表达，诱导宿主紫花苜蓿形成根瘤，从而将大气中惰性的分子氮转化成可被 植物吸收利用的化合物形式的氮。苜蓿中华根瘤菌Rml021是最为重要的一种根瘤菌，属革 兰氏阴性细菌。由于其强大的生物固氮能力，Rml021的生物学研究较为透彻。 Rml021的基因组已于2003年测序和解析，但海量的基因组信息远未得到充分利 用，仍有许多的基因功能未能阐明。研究基因功能的一个关键方法是构建此基因敲除的变 株，通过变株与原株在许多条件下的比较可以得出相应基因的生物学功能。 目前Rml021基因敲除最为常规的方法是三亲结合转移法。其实验步骤是首先PCR 获得并克隆待敲除基因两侧的约1. Okb的同源片段，克隆至含负筛选标记sacB的质粒上 后，将含此敲除的重组质粒的大肠杆菌、含tra基因（行使基因的转移的功能）的但不同抗 性的大肠杆菌菌株和Rml021这三个菌株混合，在含重组质粒抗性的平板上，筛选在菌株的 重组功能作用下利用一侧同源片段整合至基因组上的整合型菌株。sacB基因编码的蔗糖 6_果糖基转移酶催化蔗糖生成对菌株有毒性的聚蔗糖，利用含sacB基因的质粒不能在含 蔗糖的培养基上生长的特性，随后将所获得的菌株在含蔗糖的培养基上生长，促使菌株的 重组功能催化另外一侧同源片段发生整合而去除质粒骨架部分，最终筛选取抗菌株的基因 型而得到基因敲除变株。这种经典的基因敲除方法耗时（涉及多个基因克隆和测序）、繁琐 (多菌株和多个操作步骤）且效率较低（最终获得的克隆中可能含有较大比例的原株）。
技术实现思路
为简便快捷地对Rml021的基因进行敲除，以高通量地对Rml021进行功能研究并 最终开发出具有更高效率的根瘤固氮微生物基因工程菌株，本专利技术提供了一种利用重组工 程手段对Rml021进行基因敲除方法。 本专利技术所涉及的一种重组工程介导的苜蓿中华根瘤菌Rml021基因敲除方法，包 括以下步骤： (1)通过重叠一延伸聚合酶链式反应扩增获得两侧为针对待敲除基因 500bp同源 片段、中间为卡那霉素抗性基因的融合DNA片段； (2)融合DNA片段电转化至由异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导的、克隆在质粒 PLS2406中的重组酶基因表达的Rml021细胞中，在卡那霉素抗性筛选之下，卡那霉素抗性 基因取代目的基因而获得基因敲除变株； (3)将基因敲除变株在含0. 4%蔗糖的固体培养基中培养以消除含重组酶基因的 质粒 PL2S406。 本专利技术所使用的是重组工程方法来介导所转化的线性片段和基因组上同源片段 之间的同源重组。重组工程是上世纪90年代末起源的、利用重组酶催化常常是较短的同源 片段之间的同源重组而进行基因克隆和基因修饰的一种生物技术手段。短同源片段可通过 碱基合成，因此可通过PCR引物的形式加以合成，这就避免了繁琐的基因克隆操作步骤。最 常用的重组酶基因是来源自λ噬菌体的、位于一个操纵元上的 exo、bet和gam三个基因。 各基因的功能为：exo基因编码DNA5'至3'外切酶，其外切双链DNA分子而得到DNA单链； bet基因编码单链结合蛋白，其结合在DNA单链上并行使同源片段之间的同源重组功能； gam基因编码抑制内源性核酸酶的Gam蛋白，可避免细胞本身对外源基因的降解。 本专利技术所使用的表达重组酶基因的质粒PLS2406是由如下方法获得：以λ噬菌体 DNA为模板，SEQ ID NO. 1和SEQ ID Ν0. 2的序列为引物PCR扩增得到1. 9kb的DNA片段，以 SacI和Xbal酶切后，克隆至以同样酶切的pBluescript II KS (-)，经测序验证，得到重组克 隆pNdRed ;pNdRed以Ndel和Xbal酶切，分离1. 9kb的DNA片段，与同样酶切的pSRKGm连 接，固体培养基中加入25 μ g/ml庆大霉素，IPTG和X-gal (5-溴-4氯-3-吲哚-β -D-半 乳糖苷）进行筛选；挑取白色的克隆提质粒酶切鉴定，得到重组克隆PLS2405 ;pKsaCB以 Xbal和BamHI酶切，分离1. 8kb的sacB基因片段，与以同样酶切并经碱性磷酸酯酶处理的 PLS2405相连，通过酶切鉴定获得重组克隆pLS2406。 将重组酶基因自λ噬菌体扩增后克隆在plac启动子之下，plac启动子由调节基 因 lacl严谨调控。在没有诱导剂存在时lacl基因编码的LacI为抑制蛋白，抑制plac启 动子的表达；当环境中含有诱导剂（如本专利技术中所使用的IPTG)时，诱导剂和LacI结合以 解除抑制，plac启动子得以表达，即驱动下游重组酶基因的表达而行使催化作用。plac启 动子的严谨性保证了重组酶的瞬时表达（即只在有IPTG存在时才能表达），这就最大程度 地避免了重组酶所催化的、质粒上的DNA片段和基因组上DNA片段以及基因组DNA片段之 间的异常重组。 在获得单一的或多个基因敲除变株后，表达重组酶基因的质粒常常不再需要。 为达到这一目的，pLS2406还克隆有sacB基因，这样将含有pLS2406的菌株在含 有〇. 4%蔗糖的培养基上生长，sacB基因行使负筛选作用，子代细胞中含有sacB基因不能 生存，因而通过培养即可获得质粒消除的菌株。 Rml021基因组上的bacA基因和exoR基因敲除的成功敲除证明本本专利方法的可 行性。bacA基因在Rml021基因组上的基因编号为SM_b20999, bacA基因编码一种内膜蛋 白，研究表明BacA蛋白失活直接影响菌体分化，无法形成具有共生固氮能力的成熟类菌体 而丧失与宿主植物建立有效共生固氮的能力。因此bacA基因敲除变株将在研究生物固氮 的机理及如何提商固氣能力方面有着重要的应用。exoR基因在Rml021基因组上的基因编 号为SMc02078，exoR基因是Rml021胞外多糖生物合成的关键调节基因。Rml021的胞外多 糖是Rml021与植物紫花苜蓿形成根瘤的生物学过程中的必需化学成分。 本专利技术的重组工程介导的基因敲除方法省略了基因克隆等耗时繁琐的步骤，因此 简洁省时，且可高通量地（即多个基因的同时）进行敲除。鉴于Rml021在生物固氮方面的 重要性，本专利技术将在生物能源方面有着重要的应用。 【附图说明】 图1是重组工程法介导的苜蓿中华根瘤菌Rml021基因敲除本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组工程介导的苜蓿中华根瘤菌Rm1021基因敲除方法，其特征在于包括以下步骤：(1)通过重叠－延伸聚合酶链式反应扩增获得两侧为针对待敲除基因500bp同源片段、中间为卡那霉素抗性基因的融合DNA片段；(2)融合DNA片段电转化至由异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷诱导的、克隆在质粒pLS2406中的重组酶基因表达的Rm1021细胞中，在卡那霉素抗性筛选之下，卡那霉素抗性基因取代目的基因而获得基因敲除变株；(3)将基因敲除变株在含0.4％蔗糖的固体培养基中培养以消除含重组酶基因的质粒pL2S406。
【技术特征摘要】
1. 一种重组工程介导的苜蓿中华根瘤菌Rml021基因敲除方法，其特征在于包括以下 步骤： (1) 通过重叠一延伸聚合酶链式反应扩增获得两侧为针对待敲除基因500bp同源片 段、中间为卡那霉素抗性基因的融合DNA片段； (2) 融合DNA片段电转化至由异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导的、克隆在质粒 PLS2406中的重组酶基因表达的Rml021细胞中，在卡那霉素抗性筛选之下，卡那霉素抗性 基因取代目的基因而获得基因敲除变株； (3) 将基因敲除变株在含0. 4%蔗糖的固体培养基中培养以消除含重组酶基因的质粒 PL2S406。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述异丙基-β -D-硫代半乳糖苷诱导重组 酶表达的Rml021细胞中，重组酶基因来源于λ噬菌体，通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 诱导而表达；重组酶基因克隆在质粒PLS406上，pLS2406同时含有负筛选标记sacB基因。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述质粒PLS406通...
【专利技术属性】
技术研发人员：尚广东，陈中秋，庄浩，李玲，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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