一种花生慢生根瘤菌及其应用制造技术

本发明专利技术属应用微生物技术领域，具体的说是一种花生慢生根瘤菌YIC61059及其应用。慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)YIC61059，该菌株已于2015年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为CGMCC No.11507。本发明专利技术菌株生长速度快，共生固氮能力强，在温室和大田环境下能够显著促进花生的生长，提高花生的产量；可用于制作高效根瘤菌剂，减少化肥使用造成的环境污染，实现增产、节氮、生态的协调一致，因此本发明专利技术在花生种植业上有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属应用微生物
，具体的说是一种花生慢生根瘤菌YIC61059及其应 用。
技术介绍
根瘤菌是一类无芽孢、能运动、好氧、化能有机营养型的杆状革兰氏阴性细菌，大 小一般为0·5-0·9μηιΧ 1 ·2-3·0μηι，鞭毛周生、端生或侧生。它广泛分布于土壤中，可以在土 壤中以营养体形式生存，也可以侵染豆科植物根部或茎部形成根瘤或茎瘤，以类菌体形式 固定空气中的氮气形成氨，供豆科植物吸收利用，形成共生固氮体系。在农业生产中，合理 利用这一体系可以促进增产，减少施用化肥的对环境造成的污染，有利于农业和生态环境 的发展。 花生，又名落花生、万寿果、长生果等，属蔷薇目，豆科一年生草本植物。花生具有 很高的经济价值，其果实含丰富的脂肪和蛋白质，可直接食用，油一部分可以用于食用，另 外还可以供给工业和医药，油柏既可以用作饲料也可肥田，茎叶可以当作燃料、怄制堆肥或 者充当动物饲料。通过选育高效花生根瘤菌和施用根瘤菌剂，可以提高花生产量和品质，增 加农民经济收入，减少化肥污染，维持生态平衡和人类可持续发展。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种花生慢生根瘤菌YIC61059及其应用。 为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为： 一种花生慢生根瘤菌，慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp. )￥1061059，该菌株已于 2015年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址 为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号），其保藏编号为CGMCC No. 11507。 所述花生慢生根瘤菌从山东省莱西市花生研究所实验基地花生新鲜根瘤中分离 筛选出，通过对其持家基因 recA基因序列与GenBank中的数据对比分析发现其与 Bradyrhizobium liaoningense 性最高，为98 · 3%。从而将分离出来的根瘤 菌YIC61059命名为Bradyrhizobium sp.YIC61059〇 该菌的菌落为圆形，菌落湿润，中间隆起，边缘整齐，乳白色半透明，不产生芽孢， 能运动，胞外多糖含量较高，经革兰氏染色结果为阴性。 根瘤菌的应用，所述根瘤菌在促进花生生长中的应用。 所述根瘤菌在促进花生种植中作为产量增产剂的应用。其，根瘤菌能提高花生根 瘤的固氮酶活性。 具体，将所述慢生根瘤菌于TY液体培养基中28 °C，180rpm摇床震荡培养2-3天，待 菌液0D600 2 1.0;将所得菌液直接喷洒在花生种子表面，而后将喷洒有菌液的花生种子直 接播种，即可使花生产量得以增长。 所述TY液体培养基(胰蛋白胨酵母提取物培养基），配方为:胰蛋白胨5g/L，酵母提 取物3g/L，无水CaCl2 Ο · 66g/L，加水定容至lOOOmL。本专利技术所具有的优点：本专利技术的高效固氮花生根瘤菌YIC61059具有较强的共生固氮能力，能够显著促进 花生根系生长，增强其光合作用，提高植株重量，增加果实产量，进而提高了花生的产量和 品质。实验结果表明，接种本专利技术菌株的花生，与不接种任何菌的花生相比，单株花生的地 上部分鲜重、干重分别增加了 18.98%和24.48%。本专利技术根瘤菌对花生的生长安全，能够与 花生建立有效的共生固氮体系，充分体现了生物固氮作用在生产实践中的应用，减少了化 肥的施用带来的土壤和环境污染。本专利技术根瘤菌的推广和应用对保护生态环境和推动绿色 农业的发展具有重要的实践价值。【附图说明】 图1为本专利技术实施例设计的田间小区实验设计图。 图2为本专利技术实施例提供的接种菌株YIC61059种植花生的田间小区试验中促进花 生主根和侧根长度效果。 图3为本专利技术实施例提供的接种菌株YIC61059种植花生的田间小区试验中促进花 生单株果实鲜重和干重效果。【具体实施方式】 以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。 本专利技术菌株生长速度快，共生固氮能力强，在温室和大田环境下能够显著促进花 生的生长，提高花生的产量;可用于制作高效根瘤菌剂，减少化肥使用造成的环境污染，实 现增产、节氮、生态的协调一致，因此本专利技术在花生种植业上有广阔的应用前景。 1.花生根瘤菌的分离、纯化和保存。 从山东省莱西市花生研究所花生育种实验基地选取植株健壮的花生，将大且饱满 的根瘤摘下洗净，用95%乙醇浸泡30s以消除表面张力，对根瘤表面进行消毒后捣碎，将浸 出液涂布于装有YMA固体培养基(甘露醇10g/L，酵母提取物3g/L，K 2HP〇4 0.25g/L，KH2P〇4 0.25g/L，MgS〇4 0.2g/L，CaC03 3g/L，NaCl 0.1g/L)的平板中，28°C倒置培养5-7天后挑取有 典型根瘤菌菌落形态（圆形、乳白色、隆起、边缘整齐不蔓延、表面光滑、较湿润、稍透明）的 菌落在TY平板上划线培养，重复3次，将纯化的单菌落经革兰氏染色后镜检，选出革兰氏染 色阴性、细胞呈杆状且形态一致的细菌作为纯化的根瘤菌菌株。初筛后共分离出112株根瘤 菌。 所述菌株短期保藏方式为，将纯化的根瘤菌菌株接种至YMA固体斜面，待菌株长好 后保藏于4°C冰箱内；长期保藏方式为:将纯化的根瘤菌菌株培养至生长期的对数后期或稳 定期，然后加入浓度为20%甘油中混匀，至_80°C冰箱中冷冻长期保存。为了进一步去除重复的根瘤菌，首先提取菌株的总DNA，然后使用持家基因 recA的 通用引物recA41F/recA640R对112株根瘤菌的持家基因 recA基因序列进行PCR扩增，将PCR 产物进行分析并最终得到12株花生根瘤菌。将获得的12株菌株在花生上进行常规的回接实 验，以确定该菌种是否有结瘤能力，在实验中使用的蛭石、花盆、浇灌用水、花生种子均进行 了常规灭菌处理。 经过45天的观察培养，发现其中7个菌株能与宿主花生有效结瘤，而接种其它5个 菌株的花生没有结瘤。因此对上述7个菌株作了保藏，以便进行后续实验。 2高效共生固氮菌株盆栽筛选实验 将初筛得到的7个菌株进行盆栽比较实验。实验方法如下：⑴菌种活化:将7株实验菌株在斜面培养基上28°C培养48h后，接种到TY液体培养 基中，28°C，150r · mirT1转速的摇床中震荡培养48h，至0D600 2 1.0,收集菌液保藏至4°C冰 箱待用。 ⑵选择颗粒饱满、种皮完整的花生种子，表面消毒后置于恒温箱内发芽。待主根长 至Ij2cm左右时，转移栽培到盛满拌有低氮营养液的灭菌蛭石的花盆中培养。将lml用TY液体 培养基活化好的供试菌菌液(0D600 = 0.8~1.0)接种于幼苗的根部，用灭菌封口膜封住花 盆，仅割开为幼苗生长的缝隙。对照处理仅在幼苗根部喷入lml灭菌的TY液体培养基;每个 处理做5个重复，共计8组。将所有培育在花盆里当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种花生慢生根瘤菌，其特征在于：慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)YIC61059，该菌株已于2015年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为CGMCC No.11507。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：解志红，吴海龙，李岩，刘卫，任承钢，姜南，杨金保，
申请(专利权)人：中国科学院烟台海岸带研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37