适用于家蚕表达的特异性整合酶phiC31及其表达调控系统和应用技术方案

本发明专利技术涉及一种适用于家蚕表达的特异性整合酶phiC31及其表达调控系统和应用，特异性整合酶phiC31的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该酶能够在家蚕中高效表达，与attP位点和attB位点联合构建表达调控系统，该系统通过phiC31识别催化attP和attB之间的翻转条件性控制启动子方向，以实现靶基因在家蚕个体水平的受控表达；为家蚕基因的功能解析和素材创新研究提供有力的工具，并为phiC31整合酶介导的基因表达控制系统在其他物种的应用提供理论和参考。

【技术实现步骤摘要】
适用于家蚕表达的特异性整合酶phiC31及其表达调控系统和应用
本专利技术属于生物
，涉及适用于家蚕表达的特异性整合酶phiC31，含涉及表达特异性整合酶phiC31的表达调控系统及其应用。
技术介绍
随着后基因组时代的到来，对基因组时期鉴定到的海量基因，尤其是与生物学性状或经济性状相关的重要基因进行功能解析，以及利用重要功能基因开展素材创新和品种改良研究，已经成为当今生物学领域最重要的研究任务和方向。而要开展海量基因的功能解析或素材创新研究，急需对传统的基因功能研究手段进行革新和拓展，其中备受瞩目的当属利用转基因技术将靶基因导入宿主体内，在个体水平开展基因的功能解析，并在众多模式物种和重要经济类动植物中得到成功应用，在解析重要基因的生物学功能和素材创新研究领域发挥了重要的作用，显示出巨大的优势和应用潜力。另一方面，利用转基因技术开展基因的功能研究要想准确阐明一个基因的功能，有效的方法通常是进行目标基因的受控表达，即让目标基因在特定的发育时期或器官组织表达，通过其时空特异表达的特征或个体表型，从而确定该基因的主要功能。当前，能够实现这一目标的方法，便是利用来自酵母的GAL4/UAS双元表达系统。在果蝇等模式生物中的成功应用证明，GAL4/UAS系统是研究基因功能最为有效的工具之一。不仅如此，该系统还可以实现不同基因在同一发育时期或器官组织的特异表达。因而，自建立以来，利用GAL4/UAS系统并依托转基因技术便成为功能基因组时代研究基因功能的重要手段。位点特异性整合酶phiC31属于丝氨酸重组酶家族，来源于链霉菌噬菌体。phiC31整合酶可以特异识别噬菌体内的attP序列(phageattachmentsite)和宿主基因组内的attB序列(bacterialattachmentsite)之间整合，从而将噬菌体DNA整合到宿主的基因组中。研究表明，attP和attB最小活性序列长度分别为39bp和34bp，整合酶phiC31识别到attP和attB后会分别从两序列的中心位置TTG后的碱基开始切割双链DNA并旋转180°，之后再连接起来后形成36bp的attL和37bp的attR。由于phiC31整合酶具有attP和attB最小活性序列短，DNA装载能力强，以及异形序列attP和attB交换整合后形成attL和attR不会被phiC31识别催化发生再次整合等突出优势，该系统已经在包括植物、哺乳动物、昆虫等多个物种的位点特异整合研究中得到广泛的应用，并在基因操作和遗传工程研究中发挥了重要的作用，成为开展基因操作的强有力工具。经过5000多年的人工饲养和驯化，家蚕不仅成为一种重要而具特色的经济昆虫，而且随着现代分子生物学的发展，家蚕亦成为国际公认的鳞翅目模式昆虫。在我国，以古代植桑养蚕发展而来的绢丝产业有着辉煌历史，它为中华民族经济发展和文化弘扬做出了持续的巨大贡献。尽管如此，由于传统的家蚕育种技术、蚕丝生产工艺等限制，近半个多世纪以来我国在家蚕优良品种培育、产量及绢丝品质性状改良等方面一直没有取得重大突破。从现有的对生物体改造利用的成功经验提示，要从根本上克服蚕丝的固有缺陷，恢复蚕丝的纺织纤维市场生机，开发新型多功能蚕丝材料，促进单一的蚕丝产业向更为广阔的非绢丝产业扩展，就必须利用现代分子遗传操作技术，对家蚕重要经济性状相关基因进行功能解析和遗传改造。随着家蚕全基因组框架图、精细图、基因芯片和遗传变异图谱的相继问世，为家蚕的品种改良和素材创新研究提供了分子靶标。而要实现对家蚕基因的功能解析和素材创新，对家蚕遗传操作技术系统提出了更高的要求和挑战。因此，急需建立家蚕基因表达调控系统，为家蚕基因的功能解析和素材创新研究提供有力的工具。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供适用于家蚕表达的特异性整合酶phiC31；本专利技术的目的之二在于提供含有所述特异性整合酶phiC31的基因表达调控系统；本专利技术的目的之三在于提供所述基因表达调控系统在家蚕个体水平的调控靶基因表达中的应用。为实现上述表达目的，本专利技术提供如下技术方案：1、适用于家蚕表达的特异性整合酶phiC31，所述特异性整合酶phiC31的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2、含有所述特异性整合酶phiC31的基因表达调控系统，所述基因表达调控系统包括表达特异性整合酶phiC31基因的表达载体和含有2个相向排列的attP位点和attB位点的表达载体。该表达系统通过phiC31识别催化attP和attB之间的翻转条件性控制启动子方向，以实现靶基因在家蚕个体水平的受控表达。优选的，所述表达特异性整合酶phiC31基因的表达载体的特异性整合酶phiC31基因3’端融合有SV40核定位信号，所述SV40核定位信号的核苷酸序列如SEQIDNO.2第1815位～1836位所示。优选的，所述表达特异性整合酶phiC31基因的表达载体由以下方法构建：将SEQIDNO.2所示序列连接到构建到psl1180[hr3CQ-Act4P-DsRed-Ser1PA]的BamHI和NotI酶切位点处。更优选的，所述含有2个相向排列的attP位点和attB位点的表达载体由以下方法构建：以家蚕Act4启动子序列为模板，SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示序列为引物进行PCR扩增，然后将扩增产物经BamHI和SalI酶切后连入psl1180[Act4P-DsRed-SV40]载体替换原有的Act4启动子正向序列，再通过AscI位点构建到pBac[3xp3EGFPaf]载体的AscI位点中，形成转基因表达载体pBac[attB-reversedAct4P-DsRed-SV40,3xp3EGFP]。3、所述基因表达调控系统在家蚕个体水平的调控靶基因表达中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了适用于家蚕表达的特异性整合酶phiC31，该能够在家蚕中高效表达，将该酶与attP和attB结合构建通过phiC31识别催化attP和attB之间的翻转条件性控制启动子方向，以实现靶基因在家蚕个体水平的受控表达；为家蚕基因的功能解析和素材创新研究提供有力的工具，并为phiC31整合酶介导的基因表达控制系统在其他物种的应用提供理论和参考。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为phiC31催化启动子翻转的基因表达控制系统示意图(A：报告载体系统，DsRed报告基因不表达；B：phiC31催化attB和attP之间的重组交换，翻转启动子；C：启动子翻转后启动下游报告基因的表达)。图2为在家蚕BmE细胞中phiC31催化家蚕Act4启动子翻转并控制报告基因的表达(A：报告载体系统，DsRed报告基因不表达；B：phiC31瞬时表达载体示意图；C：phiC31NLS瞬时表达载体示意图；D-E：单转报告载体的BmE细胞白光图和荧光图；F-G：共转报告载体和phiC31瞬时表达载体的BmE细胞白光图和荧光图；H-I：共转报告载体和phiC31NLS瞬时表达载体的BmE细胞白光图和荧光图)。图3为在家蚕BmE细胞中phiC31催化家蚕Act4启动子翻转的分子检测(A：基因组PCR检测及引物设计示意图；B：基因组PCR电泳检测，S1-S3为以共转报本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.适用于家蚕表达的特异性整合酶phiC31，其特征在于：所述特异性整合酶phiC31的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.适用于家蚕表达的特异性整合酶phiC31，其特征在于：所述特异性整合酶phiC31的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.含有权利要求1所述特异性整合酶phiC31的基因表达调控系统，其特征在于：所述基因表达调控系统包括表达特异性整合酶phiC31基因的表达载体和含有2个相向排列的attP位点和attB位点的表达载体。3.根据权利要求2所述基因表达调控系统，其特征在于：所述表达特异性整合酶phiC31基因的表达载体的特异性整合酶phiC31基因3’端融合有SV40核定位信号，所述SV40核定位信号的核苷酸序列如SEQIDNO.2第1815位～1836位所示。4.根据权利要求3所述基因表达调控系统，其特征在于：所述表达特异性整合酶phiC31基因的表达载体由以下方法构建：将SEQIDNO.2所示序列连接到构建到p...

【专利技术属性】
技术研发人员：王峰，夏庆友，许胜，王日远，赵萍，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50