抑制腺苷A2A受体功能的基因、表达载体及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种抑制腺苷A2A受体功能的基因及其表达载体和应用，该基因包含SEQ ID NO:1所示序列或其同源序列。表达载体包括SEQ ID NO:2所述序列或其同源序列。可用于治疗神经系统疾病，如阿尔兹海默病、帕金森病、抑郁等。解决了现有临床治疗技术所带来的副作用，药物分布范围局限，既能够特异性抑制A2AR功能，又可以在局部发挥功效。

【技术实现步骤摘要】
抑制腺苷A2A受体功能的基因、表达载体及应用
本专利技术涉及生物医疗
，尤其是一种抑制腺苷A2A受体功能的基因、表达载体及应用。
技术介绍
腺苷A2A受体（A2AR）是一种G蛋白偶联受体，主要分布于人类的心血管系统以及神经系统：心血管系统的A2AR主要发挥调节血管收缩而增高血压的作用；中枢神经系统中的A2AR主要分布在纹状体和嗅球等脑区中，其能够与谷氨酸能受体以及多巴胺能受体等发生相互作用并调节谷氨酸和多巴胺的释放，在神经系统的疾病如抑郁，焦虑，阿尔兹海默病，帕金森氏病，亨廷顿病等病症中发挥重要作用。大量研究表明干预这些疾病中A2AR的作用能够影响疾病的发生发展，因此A2AR也成为了治疗这些疾病潜在的新治疗靶点。目前，人为干预A2AR的作用主要通过利用其激动剂和拮抗剂，这些药理学干预手段的特异性存在着缺陷，在用于临床治疗时，特异性低的激动剂和拮抗剂将会作用于除A2AR之外的其它受体而引起副作用，限制了其临床的运用。此外，目前激动剂和拮抗剂都是以药物的形式进行给药，存在药物半衰期，药物分布范围难以控制等缺点。因此，寻找新的能够特异性抑制或激活A2AR功能，又可以在局部发挥功效的新方法将为A2AR作为治疗疾病的靶点提供有力的工具。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种抑制腺苷A2A受体功能的基因及其表达载体和应用。为了实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：一方面，本专利技术实施例公开了一种抑制腺苷A2A受体功能的基因，其包含以下任意一种：（1）SEQIDNO:1所示序列；（2）与SEQIDNO:1所示序列的同源性大于60%的序列。另一方面，本专利技术实施例还公开了一种抑制腺苷A2A受体功能的表达载体，包括以下任意一种：（1）SEQIDNO:2所示序列表示的基因。（2）与SEQIDNO:2所示序列的同源性大于60%的序列。进一步地，其包括将上述的1基因插入pcDNA3.1(+)后，转化、扩增、纯化后得到。上述的抑制腺苷A2A受体功能（Anti-A2AR）表达载体的制备方法，包括：步骤（1）构建Anti-A2AR质粒；步骤（2）将构建的Anti-A2AR质粒进行感受态细菌的转化，得到单克隆菌落；步骤（3）挑取单克隆菌落进行质粒扩增、纯化，得到Anti-A2AR载体。进一步地，所述感受态细菌为大肠杆菌DH5α。进一步地，所述质粒扩增选用LB培养基。进一步地，所述构建Anti-A2AR质粒包括将AntiA2AR表达基因插入pcDNA3.1(+)。第三方面，本专利技术的实施例还公开了上述的基因，在治疗腺苷A2A受体功能紊乱有关的疾病中的应用。尤其是作为治疗神经系统疾病的药物的应用。第四方面，本专利技术实施例还公开了上述的表达载体，在治疗腺苷A2A受体功能紊乱有关的疾病中的应用。第五方面，本专利技术实施例还公开了一种拟制腺苷A2A受体功能的病毒，包含上述的基因及病毒载体。第六方面，本专利技术实施例还公开了一种药物制剂，其包含上述的载体。进一步地，所述药物制剂的剂型包括注射液、乳剂、霜剂、膏剂或喷雾剂。本专利技术的优点：本专利技术所公开的抑制腺苷A2A受体功能的基因可在真核细胞中表达。而该基因载体，可用于局部注射或全身注射，使其在特定位置长期、稳定、特异表达，应用于大脑相关的阿尔兹海默病、帕金森病，抑郁等神经精神疾病的预防和治疗，比传统药物特异性更高。附图说明为了更好的理解本专利技术，并且更清楚的展示如何实现本专利技术，现通过示例的方式参考附图，在附图中：图1是本专利技术一实施例中的AntiA2AR可拮抗A2AR下游信号cAMP含量；图2是本专利技术一实施例中的小鼠大脑纹状体转染表达AntiA2ARAAV病毒后的旷场实验结果；图3、图4是本专利技术一实施例中的小鼠大脑纹状体转染表达AntiA2ARAAV病毒后高架十字迷宫实验结果；图5是本专利技术一实施例中的小鼠大脑纹状体转染表达AntiA2ARAAV病毒后饮水冲突实验结果。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例对本专利技术作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1AntiA2AR表达质粒的构建、扩增、纯化1.AntiA2AR表达质粒的构建该质粒由南京金斯瑞公司构建并提供DNA成品。2.感受态细菌的转化从-80℃低温冰箱中取出DH5α感受态细菌30μl，在室温下加入质粒DNA10ng，对照感受态菌液当中不加入质粒DNA，冰上放置30分钟，42℃水浴90秒，冰上放置2分钟，加入500μlLB培养基，37℃,180r/min震荡1小时，取100μl涂布于含有Amp和不含有Amp的LB固体培养基中，37℃培养过夜，观察单克隆菌落的生长情况。3.质粒扩增挑出已转化成功的质粒阳性克隆，接种于50ml的含有Amp的LB培养基中，37℃，170r/min摇晃培养13小时。按照质粒中量抽提试剂盒（AP-MD-P-25AxyPrep，Axygen）说明书进行，取50ml在LB培养基中培养过夜的菌液3000g（重力加速度）离心8分钟，弃上清并倒置吸干培养基，加入4.5ml的BufferS1，充分悬浮细菌沉淀，加入4.5ml的BufferS2，温和并充分地混合均匀使菌体充分裂解直至形成透亮的溶液，加入4.5ml4℃预冷的BufferS3K，温和并充分的混匀，直至出现颜色均一并且紧实的凝集块，室温放置5分钟。加入4.5ml4℃预冷的BufferB，温和并充分的混匀10次，8000g离心10分钟。将一个中量制备管放入50ml离心管中，吸取上述混合液转移到中量滤器当中，插入推杆垂直向下缓慢推注至中量制备管中，将一新推杆插入制备管中，垂直向下缓慢推注至一新50ml离心管中直至液体被完全推净，取出推杆加入7mlBufferW1至制备管中垂直向下缓慢推注直至液体被完全推干净，取出推杆，加入8ml的BufferW2至制备管中，将插杆插入制备管中垂直向下缓慢推注直至推干净，取下制备管头置于洁净的1.5ml离心管中，加入0.3mlBufferW2溶液，12000g离心2分钟，将制备管头置于另一个洁净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加入350μlEluentA，室温静置1分钟，12000g离心1分钟收集质粒DNA，弃制备管在滤液中加入350μl预冷的BufferETR，混合均匀后加入88μl的BufferPF，置于56℃孵育2-5分钟，室温12000g离心2分钟，取无色上相至1.5ml的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇混合均匀，室温静置10分钟，12000g离心10分钟，尽可能弃净上清后加入1ml预冷的ET-freewater洗涤沉淀，12000g离心5分钟。尽可能弃净上清在超净台中干燥5-10分钟，加入150μlEluentA溶解质粒DNA。4.鉴定取抽提得到的质粒样本5μl送往北京六合华大基因科技有限公司进行测序鉴定，测序结果如下序列表所示。SEQIDNO:1序列表GAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTGAAGCCAGGCTCCAGCGTGAAGATCTCCTGCAAGACCAGCGGCGACTCTTTCACAGCTTACAACATGAATTGGGTGAAGCAGTCCCACGGCAAGAGCCTG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抑制腺苷A2A受体功能的基因，其特征在于，包含以下任意一种：（1）SEQ ID NO: 1所示序列；（2）与SEQ ID NO: 1所示序列的同源性大于60%的序列。

【技术特征摘要】
1.一种抑制腺苷A2A受体功能的基因，其特征在于，包含以下任意一种：（1）SEQIDNO:1所示序列；（2）与SEQIDNO:1所示序列的同源性大于60%的序列。2.一种抑制腺苷A2A受体功能的表达载体，其特征在于，包括以下任意一种：（1）SEQIDNO:2所示序列表示的基因；（2）与SEQIDNO:2所示序列的同源性大于60%的序列。3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，包括将权利要求1所述的基因插入pcDNA3.1(+)后，转化、扩增、纯化后得到。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：李平，张卓航，周元国，彭艳，符胜煜，陈惺，赵艳，宁亚蕾，杨楠，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第三附属医院野战外科研究所，
类型：发明
国别省市：重庆,50