本发明专利技术公开了CREPT（S145A）突变体及其在抑制肿瘤生长中的应用。本发明专利技术采用定点突变方法将CREPT蛋白质第145位由丝氨酸S突变为丙氨酸A，得到CREPT（S145A）蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码基因序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术还将CREPT(S145A)蛋白的编码基因导入宿主细胞，获得了稳定表达CREPT(S145A)蛋白的细胞系。通过实验证明：稳定表达CREPT（S145A）蛋白的细胞系的细胞周期相关蛋白Cyclin B1转录和表达水平显著降低，并失去了促肿瘤细胞增殖和迁移的能力。说明CREPT（S145A）蛋白具有抑制肿瘤细胞的增殖和迁移的功能。
【技术实现步骤摘要】
CREPT(S145A)突变体及其在抑制肿瘤生长中的应用
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及CREPT(S145A)突变体及其在抑制肿瘤生长中的应用。
技术介绍
细胞不同时期的转换是很多蛋白调控的结果，其中最重要的调控蛋白就是CDK(cyclin-dependentkinases)，这是一类在细胞分裂的不同时期处于不同活性状态的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。当这些激酶处于激活状态时，可以磷酸化下游底物去调节细胞周期，细胞分裂的不同时期需要不同表达水平的Cyclins。CyclinD1/2/3和CDK4/6复合物的形成是细胞进入G1期所必须的。CyclinE与CDK2复合物的形成决定细胞是否可以通过G1期进入S期。CyclinA与CDK2的结合是细胞处于S期所必须的。在G2期末期和M期初期，CyclinA与CDK1的结合是促进细胞完成G2-M期转换所必需的。细胞进入M期后，CyclinB1与CDK1的结合又是必需的。在M期后期，CyclinB1的降解又是细胞离开M期进入下一个G1期所必需的。细胞周期与肿瘤发生密切相关，研究人员在寻找肿瘤相关基因的研究中发现了一种新的肿瘤相关基因CREPT(cell-cyclerelatedandexpression-elevatedproteinintumor，专利号ZL200510135513.4)。该基因能够和转录中的关键酶——RNA聚合酶II在细胞周期蛋白CyclinD1基因上结合，并且使CyclinD1基因形成环状结构，而这种环状结构的形成可能会促进基因的转录。质谱结果显示，CREPT与一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AuroraB具有密切相互作用，AuroraB激酶在细胞分裂过程起重要作用，主要在细胞分裂的G2以及M期高表达，在细胞分裂过程中染色体固缩、纺锤丝形成，动粒微管相互作用以及染色体中期赤道板形成等中都发挥着极其重要的功能。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是如何抑制肿瘤细胞的生长。为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种蛋白质。本专利技术提供的蛋白质是将CREPT蛋白质第145位氨基酸由丝氨酸突变为丙氨酸后得到的蛋白质，并将其命名为CREPT(S145A)蛋白质；所述CREPT蛋白质为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)氨基酸序列是SEQIDNo.4所示的蛋白质；b)在SEQIDNo.4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将SEQIDNo.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；d)与SEQIDNo.4所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。所述CREPT(S145A)蛋白质为SEQIDNo.2所示的蛋白质。为了解决上述技术问题，本专利技术又提供了编码CREPT(S145A)蛋白质的核酸分子。本专利技术提供的编码CREPT(S145A)蛋白质的核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：1)其编码序列是SEQIDNo.1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码CREPT(S145A)蛋白质的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码CREPT(S145A)蛋白质的DNA分子。为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了下述A1)-A3)中的任一种生物材料：A1)含有上述核酸分子的表达盒；A2)含有上述核酸分子的重组载体；A3)含有上述核酸分子的转基因细胞系。为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了上述CREPT(S145A)蛋白质或上述核酸分子或上述生物材料或CREPT蛋白质第145位氨基酸作为靶点的新用途。本专利技术提供了上述CREPT(S145A)蛋白质或上述核酸分子或上述生物材料或CREPT蛋白质第145位氨基酸作为靶点在下述B1)-B5)中的任一种：B1)抑制肿瘤细胞的生长；B2)抑制肿瘤细胞的增殖和/或迁移；B3)下调CyclinB1水平；B4)调控细胞周期；B5)开发或筛选治疗肿瘤的产品。进一步的，所述B3)中，所述CyclinB1水平为CyclinB1转录水平。所述B5)中，所述产品可为针对CREPT蛋白质第145位氨基酸的小分子抑制剂。为了解决上述技术问题，本专利技术最后提供了一种抑制肿瘤细胞的生长的方法。本专利技术提供的抑制肿瘤细胞的生长的方法包括提高肿瘤细胞中CREPT(S145A)蛋白质的表达量和/或活性。进一步的，所述提高肿瘤细胞中CREPT(S145A)蛋白质的表达量和/或活性的方法为在肿瘤细胞中过表达CREPT(S145A)蛋白质。更进一步的，所述过表达的方法为将CREPT(S145A)蛋白质的编码基因导入肿瘤细胞；所述CREPT(S145A)蛋白质的编码基因是SEQIDNo.1所示的DNA分子。在本专利技术中，所述CREPT(S145A)蛋白质的编码基因是通过pCDNA3.1-Myc-CREPT(S145A)质粒导入肿瘤细胞中。所述pCDNA3.1-Myc-CREPT(S145A)质粒为将pCDNA3.1-Myc-CREPT质粒中编码细胞周期正向调控蛋白CREPT第145位丝氨酸的密码子TCT突变为编码丙氨酸的密码子GCT，且保持pCDNA3.1-Myc-CREPT质粒的其他序列不变后得到的质粒。上述方法中，所述肿瘤细胞可为现有技术中常见的肿瘤细胞系，如人结直肠腺癌细胞系，也可为敲除CREPT的肿瘤细胞系，如敲除CREPT的人胃癌细胞系。在本专利技术中，所述人结直肠腺癌细胞系具体为DLD1细胞；所述人胃癌细胞系具体为MGC803细胞。本专利技术采用定点突变的方法将CREPT蛋白质第145位由丝氨酸Ser突变为丙氨酸Ala，得到CREPT(S145A)蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，编码基因序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术还将CREPT(S145A)蛋白的编码基因导入宿主细胞，获得了稳定表达CREPT(S145A)蛋白的细胞系。通过实验证明：稳定表达CREPT(S145A)蛋白的细胞系的细胞周期相关蛋白CyclinB1转录和表达水平显著降低，并失去了促肿瘤细胞增殖和迁移的能力。说明CREPT(S145A)蛋白具有抑制肿瘤细胞的增殖和迁移的功能，CREPT第145位丝氨酸位点对于CREPT维持其促进肿瘤形成的功能至关重要，在今后的实际应用中，可开发、设计和筛选专门针对CREPT第145位丝氨酸位点的小分子抑制剂用于肿瘤的治疗。附图说明图1为CREPT(S145A)突变体对CyclinB1转录水平的影响。图2为CREPT(S145A)突变体对人结直肠腺癌细胞系DLD1细胞生长的影响。图3为EZ-GuideXH图谱。图4为CREPT野生型及敲除CREPT的MGC803的Westernblot检测结果。图5为CREPT(S145A)突变体对人胃癌细胞系MGC803细胞生长的影响。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、CREPT(S145A)突变蛋白及其编码基因的获得1、突变位点的选取根据细胞周期正向调控蛋白CREPT和丝氨酸/苏氨本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种蛋白质，是将CREPT蛋白质第145位氨基酸由丝氨酸突变为丙氨酸后得到的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，是将CREPT蛋白质第145位氨基酸由丝氨酸突变为丙氨酸后得到的蛋白质。2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述CREPT蛋白质为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)氨基酸序列是SEQIDNo.4所示的蛋白质；b)在SEQIDNo.4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将SEQIDNo.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；d)与SEQIDNo.4所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。3.编码权利要求1或2所述蛋白质的核酸分子。4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：1)其编码序列是SEQIDNo.1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。5.下述A1)-A3)中的任一种生物材料：A1)含有权利要求3或4所述核酸分子的表...
【专利技术属性】
技术研发人员：常智杰，丁莉丹，朱丙陶，王银银，任芳丽，杨柳，冯亚瑞，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11
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