T7 RNA聚合酶的热稳定变体制造技术

本申请提供了噬菌体RNA聚合酶的变体。在一些实施方式中，所述变体相对于相应的野生型噬菌体RNA聚合酶和/或野生型T7 RNA聚合酶可具有增加的热稳定性。本申请还提供了使用所述变体的组合物、试剂盒和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】T7RNA聚合酶的热稳定变体
技术介绍
热稳定性和热活性酶在学术研究和工业应用中具有很强的实用性。来自嗜热生物的酶的高稳定性使得分子生物学和诊断学方面的一些技术成为可能(例如聚合酶链式反应)。然而，来自嗜热生物的等效酶并不总存在。在这些情况下，定向进化或计算方法可以作为识别具有热稳定性的嗜温酶变体的有力工具。例如，目前的体外转录方法反应温度被限制在45℃以下。进行这些反应的典型的病毒RNA聚合酶在升高的温度下不具有活性，因此需要识别具有热活性且稳定的变体以实现在升高的温度下进行体外转录反应。专利技术概述本申请提供了噬菌体RNA聚合酶的变体。在一些实施方式中，所述变体相对于相应的野生型RNA聚合酶，在升高的反应温度下可具有增加的热稳定性和/或活性。本申请还提供了使用所述变体的组合物、试剂盒和方法。在一些实施方式中，所述变体：(i)包含与SEQIDNO：1具有至少80％(例如至少90％，或至少95％)序列同一性的氨基酸序列；和(ii)包含在对应于SEQIDNO：1的第109、205、388、534、567和618位中的一个或多个位置的氨基酸取代。在一些实施方式中，所述变体可以包含对应于SEQIDNO：1的第109、205、388、534、567和618位中的至少两个位置的氨基酸取代。在一些实施方式中，所述变体可以包含对应于SEQIDNO：1的第109、205、388、534、567和618位中的至少3个位置的氨基酸取代。在一些实施方式中，所述变体在对应于SEQIDNO：1的第109、205、388、534、567和618位的位置可以包含氨基酸取代。例如，在一些实施方式中，所述变体可以包含一个或多个以下氨基酸取代：I109L、H205S、D388E、L534V、V567P和G618Q，其中所述氨基酸取代位于和SEQIDNO：1中位置对应的位置。在一个示例中，所述变体还包含对应于以下位置中的一个或多个位置的氨基酸取代：SEQIDNO：1的第75、83、108、206、227、281、297、312、323、327、333、340、354、362、375、428、446、454、461、495、510、584、591、642、711、724、740、788、832、834、835、843、847、849、856、863、866和877位。在另一个示例中，所述变体还可以包含对应于以下位置中的至少10个位置的氨基酸取代：SEQIDNO：1的第75、83、108、206、227、281、297、312、323、327、333、340、354、362、375、428、446、454、461、495、510、584、591、642、711、724、740、788、832、834、835、843、847、849、856、863、866和877位。在另一个示例中，所述变体可以包含以下的一个或多个氨基酸取代：T75Q、A83K、E108L、K206P、V227I、I281P、V297I、Y312D、A323I、A327P、K333P、V340E、A354Q、M362P、T375K、T375N、A428P、L446F、K454P、K461R、S495N、C510Q、A584K、D591E、K642R、K711R、A724P、K740R、G788A、M832F、D834E、T835L、A843Q、D847E、F849V、S856T、A863P、A866K和E877R，其中所述氨基酸取代位于和SEQIDNO：1中位置对应的位置。在另一个示例中，所述的分离的噬菌体RNA聚合酶变体，其中所述变体包含以下的至少10个氨基酸取代：T75Q、A83K、E108L、K206P、V227I、I281P、V297I、Y312D、A323I、A327P、K333P、V340E、A354Q、M362P、T375K、T375N、A428P、L446F、K454P、K461R、S495N、C510Q、A584K、D591E、K642R、K711R、A724P、K740R、G788A、M832F、D834E、T835L、A843Q、D847E、F849V、S856T、A863P、A866K和E877R，其中所述氨基酸取代位于和SEQIDNO：1中的位置对应的位置。在一些实施方式中，上述任何分离的噬菌体RNA聚合酶变体可包含融合至外源DNA结合结构域的融合体。表1中提供了示例。在另一个实施方式中，由于所述一个或多个氨基酸取代，所述变体在至少45℃(例如在50℃或高于50℃，或者在55℃或高于55℃)的温度下相对于SEQIDNO：1所示的T7RNA聚合酶具有增加的稳定性。本申请还提供了一种组合物，其包括：i.上述分离的噬菌体RNA聚合酶变体；和ii缓冲剂。所述组合物还可以包含核糖核苷三磷酸和/或经修饰的核苷酸。所述组合物还可以包含模板DNA分子，所述模板DNA分子包含：噬菌体启动子(例如T7或T3RNA聚合酶启动子)，其与待转录的靶核苷酸序列可操作地连接。本申请还提供了一种试剂盒，其包括：i.上述任何一种的分离的噬菌体RNA聚合酶变体；和ii.反应缓冲液。所述试剂盒还可以包含一种或多种核糖核苷三磷酸和/或修饰的核苷酸。本申请还提供了一种合成RNA分子的方法，包括(a)将上述分离的噬菌体RNA聚合酶变体与核糖核苷三磷酸和/或经修饰的核苷酸以及模板DNA分子组合，所述模板DNA分子包含噬菌体RNA聚合酶启动子，所述噬菌体RNA聚合酶启动子与待转录的靶核苷酸序列可操作地连接，产生反应混合物；并且(b)温育所述反应混合物以将所述模板DNA分子转录成RNA。一方面，所述温育在至少45℃或在高于50℃或在高于55℃(例如45℃至60℃，45℃至50℃，50℃至55℃或55℃或60℃)的温度下进行。噬菌体RNA聚合酶的一个例子是T7RNA聚合酶。通过引用并入本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本申请，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入。附图简述本领域技术人员将理解，下面描述的附图仅用于说明目的。附图不旨在以任何方式限制本申请教导的范围。图1A-1D是显示各种氨基酸取代对T7RNA聚合酶(SEQIDNO：1)活性的影响的图表。图1A-1C显示了具有单个突变的所选变体的数据。这些反应在45℃下进行10小时(图1A和图1B)，在37℃下进行2小时，然后在45℃下进行8小时(图1C)。图1D显示了通过TthPURE测定鉴定的个体突变的累加效应。反应在45℃下进行10小时。使用公式(M-WT)/WT估计变体的热稳定性，其中M和WT代表来自与T7RNA聚合酶变体和野生型的mRNA分别进行10小时反应中合成的GFP的荧光信号的最大值。在该测定中，如果变体聚合酶具有“0”活性，则其具有与野生型T7RNA聚合酶相当的活性。如果变体聚合酶具有“0.5”的活性，则其相对于野生型T7RNA聚合酶的活性增加50％。图1A-1C显示了T7RNA聚合酶的45个单氨基酸变体的结果。图1D显示了组合氨基酸取代时的累加效应。在图1D中，显示了1、2、3、4、5和6个氨基酸取代的累加效应。图2显示了野生型T7RNA聚合酶(WT)及其各种变体(即M1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的噬菌体RNA聚合酶变体，其中所述变体：(i)包含与SEQ ID NO：1具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和(ii)包含在对应于选自以下位置中的一个或多个位置的氨基酸取代：SEQ ID NO：1的第109、205、388、534、567和618位。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.01.13 US 62/278,161;2016.11.03 US 62/416,7701.一种分离的噬菌体RNA聚合酶变体，其中所述变体：(i)包含与SEQIDNO：1具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和(ii)包含在对应于选自以下位置中的一个或多个位置的氨基酸取代：SEQIDNO：1的第109、205、388、534、567和618位。2.根据权利要求1所述的分离的噬菌体RNA聚合酶变体，其中所述变体包含对应于选自以下位置中的至少两个位置的氨基酸取代：SEQIDNO：1的第109、205、388、534、567和618位。3.根据任何前述权利要求的分离的噬菌体RNA聚合酶变体，其中所述变体包含对应于选自以下位置中的至少3个位置的氨基酸取代：SEQIDNO：1的第109、205、388、534、567和618位。4.根据前述权利要求中任一项所述的分离的噬菌体RNA聚合酶变体，其中所述变体在对应于SEQIDNO：1的第109、205、388、534、567和618位的位置包含氨基酸取代。5.根据前述权利要求中任一项所述的分离的噬菌体RNA聚合酶变体，其中所述变体包含选自I109L、H205S、D388E、L534V、V567P和G618Q的一个或多个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代位于和SEQIDNO：1中位置对应的位置。6.根据前述权利要求中任一项所述的分离的噬菌体RNA聚合酶变体，其中所述变体还包含对应于选自以下位置中的一个或多个位置的氨基酸取代：SEQIDNO：1的第75、83、108、206、227、281、297、312、323、327、333、340、354、362、375、428、446、454、461、495、510、584、591、642、711、724、740、788、832、834、835、843、847、849、856、863、866和877位。7.根据前述权利要求中任一项所述的分离的噬菌体RNA聚合酶变体，其中所述变体还包含对应于选自以下位置中的至少10个位置的氨基酸取代：SEQIDNO：1的第75、83、108、206、227、281、297、312、323、327、333、340、354、362、375、428、446、454、461、495、510、584、591、642、711、724、740、788、832、834、835、843、847、849、856、863、866和877位。8.根据前述权利要求中任一项所述的分离的噬菌体RNA聚合酶变体，其中所述变体包含选自以下的一个或多个氨基酸取代：T75Q、A83K、E108L、K206P、V227I、I281P、V297I、Y312D、A323I、A327P、K333P、V340E、A354Q、M362P、T375K、T375N、A428P、L446F、K454P、K461R、S495N、C510Q、A584K、D591E、K642R、K711R、A724P、K740R、G788A、M832F、D834E、T835L、A843Q...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·翁，S·庄，H·浅原，K·C·洪，V·波塔波夫，G·采齐尼斯，
申请(专利权)人：新英格兰生物实验室公司，
类型：发明
国别省市：美国,US