一种检测OCA2基因多态性的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测OCA2基因多态性的试剂盒，试剂盒包括检测OCA2基因上的rs1800414号位点的特异性引物及特异性荧光探针、内参基因β‑actin检测位点的特异性引物及特异性荧光探针、阳性质控品、阴性质控品、Taq DNA聚合酶和PCR反应缓冲液等。本发明专利技术试剂盒可用检测OCA2基因多态性，针对OCA2特异性SNP位点设计检测引物和探针，灵敏性高、特异性强；检测对象来源于口腔拭子，整个检测过程为无创检测；为OCA2基因多态性检测提供新的试剂盒，方便应用。

【技术实现步骤摘要】
一种检测OCA2基因多态性的试剂盒
本专利技术涉及一种检测OCA2基因多态性的试剂盒。
技术介绍
色素沉着是人体皮肤由于种种原因而致皮肤呈现不同颜色、不同范围及不同深浅的色素变化。色素沉着的变化是由影响产生的黑素体数量、黑色素的类型、黑素体的大小和形状的生物化学差异引起的。皮肤色素沉着的成因，通常受阳光、紫外线辐射或化妆品、药物及其它物质刺激后，形成黑色的皮肤色素沉积而成。皮肤色素沉着按等级可分为I级为轻度光老化，没有明显可见的素色沉积，无需使用遮瑕霜遮盖色斑；II级为中度光老化，此时色素沉积更多、更明显，出现棕色色斑、肤色不均、雀斑等；III级为高度光老化。此时色素沉积问题加重，出现黄褐斑、太田痣等，往往很难去除；IV级为重度光老化，出现严重的皱纹、色斑等。长期以来人们认识到，个体之间的色素差异是由遗传性状引起的。研究表明，皮肤黑色素沉着与OCA2(OculocutaneousAlbinismII)基因的His615Arg(rs1800414)相关。携带G等位基因变异的人相比A祖先等位基因纯合子的人，具有较强的抗黑色素能力。OCA2基因位于15号染色体，由24个外显子和23个内含子构成。该基因编码黑素体跨膜蛋白，参与小分子转运，尤其是络氨酸的转运，而络氨酸是黑色素合成的前体。该基因参与黑色素沉积，控制着皮肤黑色素的变化。目前进行基因多态性检测的方法有数十种。金标准法为基因测序法。基因测序法是目前应用最广泛、较准确的一种方法，但是该方法需要昂贵的仪器设备和专业的人员进行操作，费时费力，在临床上很难进行推广。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术中检测OCA2基因多态性的方法操作复杂的缺陷，提供一种检测OCA2基因多态性的试剂盒。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案：一种检测OCA2基因多态性的试剂盒，包括检测OCA2基因上的rs1800414号位点的特异性引物及特异性荧光探针、内参基因β-actin检测位点的特异性引物及特异性荧光探针、阳性质控品、阴性质控品、TaqDNA聚合酶和PCR反应缓冲液。所述检测OCA2基因上的rs1800414号位点的特异性引物及特异性荧光探针的序列为：正向引物：5’-AGTCAGAAGGTTGTGCAGAGTAA-3’反向引物：5’-GCCAGGGACAAACGAATTGAG-3’野生型探针：5’-FAM-TGTGGTTTCTCTCTTACAGCATAG-BHQ2-3’突变型探针：5’-HEX-TGTGGTTTCTCTCTTACAGCGTAG-BHQ2-3’。进一步的，所述内参基因β-actin检测位点的特异性引物及特异性荧光探针序列为：正向引物：5’-GATGGAGGAGGTTTAGTAA-3’反向引物：5’-AATAAAACCTACTCCTCCCT-3’特异性探针：5’-VIC-CCACCACCCAACACACAATAACAAACA-BHQ2-3。进一步的，阳性质控品包括阳性质控品1、阳性质控品2和阳性质控品3，所述阴性品为ddH2O；所述阳性质控品1为靶序列的野生纯合子质粒，所述靶序列为：GAGTCAGAAGGTTGTGCAGAGTAAATGAGCTGTGGTTTCTCTCTTACAGCATAGGATATCTGACGGGATTCTGCTCGCCAAATGCCTGACAGTGTTGGGATTTGTTATCTTCATGTTTTTCCTCAATTCGTTTGTCCCTGGCATTCATCT所述阳性质控品2为靶序列的突变纯合子质粒，所述靶序列为：GAGTCAGAAGGTTGTGCAGAGTAAATGAGCTGTGGTTTCTCTCTTACAGCGTAGGATATCTGACGGGATTCTGCTCGCCAAATGCCTGACAGTGTTGGGATTTGTTATCTTCATGTTTTTCCTCAATTCGTTTGTCCCTGGCATTCATCT所述阳性质控品3为野生纯合子质粒与突变纯合子质粒组成的质粒混合物；其中，质粒载体为pUC57；所述阳性质控品3中野生纯合子质粒和突变纯合子质粒的数量比为1:1。进一步的，检测OCA2基因上的rs1800414号位点的特异性引物及特异性荧光探针中正义引物的Tm值为59.6℃，反向引物的Tm值为59.8℃；野生型探针的Tm值为69℃，突变型探针的Tm值为70℃。试剂盒的保存温度为-20℃，检测的对象为人口腔拭子。本专利技术的试剂盒其用于检测OCA2基因多态性的方法为：1)采集样本：用清水漱口10-30分钟后，手持棉签，伸进口腔，在口腔内侧颊粘膜处反复擦拭20次以上；2)DNA提取：利用试剂盒提取DNA，并检测DNA的质量和纯度；3)实时荧光定量PCR反应：反应条件为95℃预变性处理5min；95℃下15s，58℃下1min，40个循环；4)检测结果分析：当荧光定量PCR扩增曲线仅FAM荧光起线，HEX荧光不起线时，待测样本为OCA2基因上rs1800414号SNP位点纯合野生型；当荧光定量PCR扩增曲线FAM和HEX两条荧光都起线，待测样本为OCA2基因上rs1800414号SNP位点杂合型。当荧光定量PCR扩增曲线仅HEX荧光起线，FAM荧光不起线，待测样本为OCA2基因上rs1800414号SNP位点纯合突变型。本专利技术所达到的有益效果是：本专利技术针对OCA2特异性SNP位点设计检测引物和探针，灵敏性高、特异性强；检测对象来源于口腔拭子，整个检测过程为无创检测；为OCA2基因多态性检测提供新的试剂盒，方便应用。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1是OCA2基因上rs1800414号SNP位点纯合野生型样本的荧光定量PCR扩增曲线；图2是OCA2基因上rs1800414号SNP位点杂合型样本的荧光定量PCR扩增曲线；图3是OCA2基因上rs1800414号SNP位点纯合突变型样本的荧光定量PCR扩增曲线。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例一种检测OCA2基因多态性的试剂盒，包括浓度为10μM的检测OCA2基因上的rs1800414号位点的特异性引物共0.4μL，其中正向引物和反向引物各0.2μL；浓度为5μM检测OCA2基因上的rs1800414号位点的特异性荧光探针共0.2μL，其中野生型探针和突变型探针各0.1μL；浓度为10μM内参基因β-actin检测位点的特异性引物共0.4μL，其中正义引物和反义引物各0.2μL；浓度为5μM内参基因β-actin检测位点的的特异性荧光探针共0.2μL；浓度为5单位/μl的TaqDNA聚合酶0.2μL；PCR反应缓冲液15μL，包括MgCl2：25mmol/L；dNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)：20mmol/L；去离子水20μL。检测OCA2基因上的rs1800414号位点的特异性引物及特异性荧光探针的序列为：正向引物：5’-AGTCAGAAGGTTGTGCAGAGTAA-3’反向引物：5’-GCCAGGGACAAACGAATTGAG-3’野生型探针：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测OCA2基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括检测OCA2基因上的rs1800414号位点的特异性引物及特异性荧光探针、内参基因β‑actin检测位点的特异性引物及特异性荧光探针、阳性质控品、阴性质控品、Taq DNA聚合酶和PCR反应缓冲液；所述检测OCA2基因上的rs1800414号位点的特异性引物及特异性荧光探针的序列为：正向引物：5’‑AGTCAGAAGGTTGTGCAGAGTAA‑3’反向引物：5’‑GCCAGGGACAAACGAATTGAG‑3’野生型探针：5’‑FAM‑TGTGGTTTCTCTCTTACAGCATAG‑BHQ2‑3’突变型探针：5’‑HEX‑TGTGGTTTCTCTCTTACAGCGTAG‑BHQ2‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种检测OCA2基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括检测OCA2基因上的rs1800414号位点的特异性引物及特异性荧光探针、内参基因β-actin检测位点的特异性引物及特异性荧光探针、阳性质控品、阴性质控品、TaqDNA聚合酶和PCR反应缓冲液；所述检测OCA2基因上的rs1800414号位点的特异性引物及特异性荧光探针的序列为：正向引物：5’-AGTCAGAAGGTTGTGCAGAGTAA-3’反向引物：5’-GCCAGGGACAAACGAATTGAG-3’野生型探针：5’-FAM-TGTGGTTTCTCTCTTACAGCATAG-BHQ2-3’突变型探针：5’-HEX-TGTGGTTTCTCTCTTACAGCGTAG-BHQ2-3’。2.如权利要求1所述的检测OCA2基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述内参基因β-actin检测位点的特异性引物及特异性荧光探针序列为：正向引物：5’-GATGGAGGAGGTTTAGTAA-3’反向引物：5’-AATAAAACCTACTCCTCCCT-3’特异性探针：5’-VIC-CCACCACCCAACACACAATAACAAACA-BHQ2-3。3.如权利要求2所述的检测OCA2基因多态性的试剂盒，其特征在于，阳性质控品包括阳性质控品1、阳性质控品2和阳性质控品3，所述阴性品为ddH2O；所述阳性质控品1为靶序列的野生纯合子质粒，所述靶序列为：GAGTCAGAAGGTTGTGCAGAGTAAATGAGCTGTGGTTTCTCTCTTACAGCATAGGATATCTGACGGGATTCTGCTCGCCAAATGCCTGACAGTGTTGGGATTTGTTATCTTCATGTTTTTCCTCAATTCGTTTGTCCCTGGCATTCATCT所述阳性...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘小曼，姚鲁帅，王莎，
申请(专利权)人：无锡正则精准医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32