一种银狐/赤狐裘皮制品的MGB探针鉴别法制造技术

本发明专利技术公开了一种荧光PCR鉴定银狐/赤狐裘皮制品真伪的检测方法，包括银狐/赤狐上游引物：VV‑F；银狐/赤狐下游引物：VV‑R；银狐/赤狐探针：VV‑P；检测方法：提取样品DNA；对样品DNA进行荧光PCR扩增；对扩增曲线分析后判定结果。通过特异性实验、灵敏度实验、重复性实验和盲测实验,结果表明，本发明专利技术特异性好、灵敏度高、效率高，克服了普通PCR检测方法的缺点，具有良好的应用前景。

Identification of a silver fox / red fox fur product by MGB probe

The invention discloses a detection method for identifying the authenticity of silver fox/red fox fur products by fluorescent PCR, including the upstream primer of silver fox/red fox: VV_F; the downstream primer of silver fox/red fox: VV_R; the silver fox/red fox probe: VV_P; the detection method: extracting sample DNA; amplifying sample DNA by fluorescent PCR; and determining after analyzing the amplification curve. Result. The results of specificity test, sensitivity test, repeatability test and blind test show that the invention has good specificity, high sensitivity and high efficiency, overcomes the shortcomings of common PCR detection method, and has good application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种银狐/赤狐裘皮制品的MGB探针鉴别法
本专利技术涉及一种基于MGB探针的荧光PCR鉴定银狐/赤狐裘皮制品的检测方法，涉及分子检验鉴定

技术介绍
银狐又叫银黑狐、玄狐，是赤狐(Vulpesvulpes)在自然条件下的毛色变异种，是世界上养殖的主要狐狸品种之一，为现代高级裘皮。毛绒细柔丰厚，色泽艳丽，皮质轻薄，御寒性强，可制作服装、帽子、毛条、领子等。赤狐是最常见的野生狐狸，毛色因季节和地区不同而变异很大，南方地区所产毛被薄而短，北方所产毛长而丰密，是传统的裘皮。当今，裘皮以传统的保暖为主的功能型转变为以装饰为主的潮流时尚型，成为普及化的奢侈品，市场需求日益增长。由于裘皮产品的商业利润巨大，市场上常出现假冒、仿冒等以假乱真的现象。所以，建立一种高效准确的裘皮制品检测方法迫在眉睫。目前裘皮鉴定方法主要为宏观形态学法、微观形态学法和分子生物学法。由于裘皮加工工艺多样化，许多裘皮制品依据宏观特征或微观特征难以鉴别；分子生物学方法中，由于鞣制毛皮的DNA降解和片段化严重，普通PCR法的灵敏度差、准确率低。探针法实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR，qPCR)是在PCR反应体系中加入化学修饰的寡聚核苷酸探针。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收不会有荧光信号被检测到。而当探针可特异性结合、PCR扩增时，Taq酶的5’-3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。MGB探针是在传统TaqMan探针的基础上改进，通过在探针3’端加入MGB基团，提高探针的退火温度，缩短探针的长度，提高了探针的特异性和灵敏度。目前，用于狐狸物种鉴定的目的基因主要有线粒体的12SrRNA基因、16SrRNA基因、COI基因和D-loop序列等，其中12SrRNA基因和16SrRNA基因进化缓慢，种间差异较小；D-loop序列种内变异较大，不适合进行物种鉴定；而线粒体COI基因和COII基因比12SrRNA基因和16SrRNA基因进化更快，物种差异较大，适用于物种鉴定。已有的研究主要设计的是通用探针，如蓝狐和赤狐的通用探针、或赤狐和北极狐的通用探针，无法准确鉴别具体物种。为准确鉴别银狐/赤狐裘皮制品的真伪，设计物种特异性引物和探针。由于银狐是赤狐的毛色基因突变种，因此选择赤狐与银狐的线粒体COII序列上的同源性较高的序列片段作为目的基因，设计了可以扩增赤狐和银狐的引物和探针，既可以应用于野生的赤狐裘皮制品检测，又可以应用于人工养殖的银狐裘皮制品检测，并可以灵敏地区别其他狐狸制品。本专利技术建立了一种鉴别银狐/赤狐裘皮制品真伪的荧光PCR检测方法，利用MGB探针，能够高效、准确和快速的检测银狐/赤狐裘皮制品的真伪。本专利技术针对线粒体COII基因设计引物和MGB探针。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是设计针对银狐(赤狐)的特异性引物和探针。本专利技术的第二个目的是建立快速区分银狐(赤狐)裘皮制品的分子检测方法。为了达到上述目的，本专利技术采用以下方案：1、鞣制毛的预处理及DNA提取A、鞣制毛的预处理取银狐/赤狐的针毛20根以上(平均长约5～6cm)、绒毛或针绒混合样5mg以上，放入2mL离心管中，使用75％乙醇浸泡5min，再用ddH2O洗涤3次，晾干。B、鞣制毛DNA的提取将处理后的银狐/赤狐毛剪碎，加入280μLTNE、30μL10％SDS、20μL蛋白酶K、20μLDTT，立即涡旋振荡1min混合均匀。瞬时离心后，将离心管置于56℃水浴中过夜消化处理。参照AXYGEN动物基因组提取试剂盒(或等效试剂盒)说明书进行，加入350μL蛋白去除液，涡旋振荡30s均匀混合，12000r/min离心10min。将DNA制备管置于2mL离心管中，将离心后的上清移至制备管中，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入500μL洗涤液，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入700μL去盐液，12000r/min离心1min。弃滤液，重复一次去盐过程。弃滤液后，离心1min。将DNA制备管转移到新1.5mL离心管中，加入65℃预热的Eluent洗脱液70μL制备DNA，-20℃冷冻备用。2、引物和探针的设计选取GenBank上已发表的赤狐和银狐线粒体COII序列，利用Blast进行比对后，选择物种特异的DNA位点，利用ABIprimerexpress3.0设计引物与MGB探针，Primer6.0分析引物二级结构，将所设计的引物和探针利用Blast再次进行比对分析，确保引物与探针的特异性。引物和探针设计结果：3、本专利技术中荧光PCR检测方法的建立在FastStartUniversalProbeMaster(Rox)的基础上，建立20μL反应体系，其中上下游引物和MGB探针的量从0.3μL到1.5μL，以0.1μL为梯度递加。反应体系中加入模板7μL其余用水补足。根据荧光定量PCR的结果，选择最大的荧光增量和最好的曲线走势作为判定标准，选择引物和探针的最适量。最优反应体系：FastStartUniversalProbeMaster(Rox)10μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，探针0.5μL，DNA模板8.5μL。PCR反应程序如下：95℃10min，95℃10s，58℃30s，40个循环，循环在退火时收集荧光信号。判图原则：Ct值小于等于35并有明显扩增曲线判为阳性；Ct值大于等于40判为阴性；Ct值介于35～40之间判为可疑，DNA模板加倍重复实验，如果Ct值减小并拥有明显扩增曲线判为阳性，否则判为阴性。4、本专利技术中荧光PCR特异性实验利用银狐/赤狐引物和探针，分别对银狐、赤狐、浣熊、狼、犬、北极狐、沙狐、藏狐、貉、紫貂、水貂、石貂、青鼬、白鼬、绵羊、羊驼、豹猫、家猫、漠猫、猞猁、雪豹、东北虎、孟加拉虎、小灵猫、塔里木兔、水牛、棕熊、黑熊、麝鼠进行物种特异性实验，反应体系按照荧光定量PCR检测方法所确定的最佳反应体系建立。5、本专利技术中荧光PCR的灵敏度实验将银狐/赤狐的DNA提取液原液按照10倍的梯度倍比稀释，得到100、10-1、10-2、10-3、10-4倍的DNA溶液。用相应的银狐/赤狐引物和探针进行检测。6、重复性实验取银狐非鞣制毛及鞣制毛和赤狐非鞣制毛及鞣制毛共20份，分别用银狐/赤狐的引物和探针进行检测，检测结果进行回判率分析。7、盲测实验随机准备10份样品，其中一份为银狐/赤狐的样品，而其他9份都不含有银狐/赤狐成分。对这10份样品进行盲测实验，通过该盲测实验对本方法的有效性进行检验。附图说明图1为引物和探针的特异性实验结果图2为灵敏度实验结果图3为重复性实验结果图4为盲测实验结果具体实施方式实施例1疑似银狐/赤狐制品的检测1、样品的预处理及DNA提取(1)样品的预处理取疑似银狐/赤狐鞣制的针毛20根，平均长约7cm，放入2mL离心管中，使用75％的乙醇浸泡5min，再用ddH2O洗涤3次，晾干。(2)样品DNA的提取将处理后的样品剪碎为0.2～0.5cm，加入280μLTNE、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用MGB探针荧光PCR法鉴定银狐/赤狐裘皮制品真伪的检测方法，其特征在于包括特异性引物和探针的序列如下：上游引物VV‑F：5’‑CGAGTCGTTCTCCCAATGGA‑3’，下游引物VV‑R：5’‑CATGAGTGCAATACGTCTTCTGAA‑3’，探针VV‑P：5’‑(VIC)AACTGTCCGAATACTTATTT(MGB)‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种利用MGB探针荧光PCR法鉴定银狐/赤狐裘皮制品真伪的检测方法，其特征在于包括特异性引物和探针的序列如下：上游引物VV-F：5’-CGAGTCGTTCTCCCAATGGA-3’，下游引物VV-R：5’-CATGAGTGCAATACGTCTTCTGAA-3’，探针VV-P：5’-(VIC)AACTGTCCGAATACTTATTT(MGB)-3’。2.根据权利1所述的利用MGB探针荧光PCR法鉴定银狐/赤狐制品真伪的检测方法，其特征在于构建20μL荧光反应体系，由以下组分组成：FastStartUniversalProbeMaster(Rox)10μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，探针0.5μL，DNA模板8.5μL。3.一种采用如权利1、权利2所述的利用MGB探针荧光PCR法鉴定银狐/赤狐制品真伪的检测方法，其特征在于包括以下步骤：A、提取样品DNAB、对步骤A中的样品DNA进行荧光PCR扩增，其中反应体系由以下组分组成：FastStartUniversalProbeMaster(Rox)10μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，探针0.5μL，DNA模板8.5μL。所述的引物和探针：银狐/赤狐上游引物VV-F：5’-CGAGTCGTTCTCCCAATGGA-3’银狐/赤狐下游引物VV-R：5’-CATGAGTGCAATACGTCTTCTGAA-3’银狐/赤狐探针VV-P：5’-(VIC)AACTGTCCGAATACTTATTT(MGB)-3’C、对扩增后的曲线情况进行结果判定，按照以下判定原则：Ct值小于...

【专利技术属性】
技术研发人员：白素英，程前，刘微，张伟，王震，马跃，张宇，金煜，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23