一种鲢鳙通用微卫星荧光多重PCR的方法技术

本发明专利技术涉及一种鲢鳙通用微卫星荧光多重PCR的方法，属于水产养殖领域中水产动物种质鉴定技术领域。其首先收集收集鲢鳙鳍条样本，并采用传统酚‑氯仿的方法提取基因组DNA，随后根据目的扩增片段长度差异的要求涉及引物对，选取扩增条带清晰的3组4重PCR体系，共涉及12个微卫星标记，最后对引物进行荧光修饰及扩增验证。本发明专利技术所述多重PCR方法，具有操作快捷、实施简便、费用低廉等特点，可为鲢鳙种质遗传评估和家系选育等研究提供一种新的分子标记辅助技术。

A method of universal microsatellite fluorescence multiplex PCR for silver carp and Bighead Carp

The invention relates to a general microsatellite fluorescence multiplex PCR method for silver carp and Bighead carp, belonging to the technical field of Aquatic Animal Germplasm Identification in the field of aquaculture. Firstly, the fin strips of silver carp and bighead carp were collected and genomic DNA was extracted by traditional phenol-chloroform method. Then, according to the requirements of different length of the target amplified fragments, primer pairs were involved. Three groups of 4-fold PCR systems with clear amplified bands were selected, involving 12 microsatellite markers. Finally, the primers were modified by fluorescence and verified by amplification. The multiplex PCR method of the invention has the advantages of fast operation, simple implementation and low cost, and can provide a new molecular marker assistant technology for the genetic evaluation of silver carp and Bighead Carp germplasm and the breeding of families, etc.

【技术实现步骤摘要】
一种鲢鳙通用微卫星荧光多重PCR的方法
本专利技术涉及一种鲢鳙通用微卫星荧光多重PCR的方法，适用于鲢鳙群体遗传变异和亲子鉴定等研究，属于水产养殖领域中水产动物种质鉴定

技术介绍
鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)和鳙(Hypophthalmichthysnobilis)为鲤科鱼类中的近缘物种，作为中国重要土著鱼类，广泛分布于各大江河湖泊中。两者均属虑食性鱼类，是净水渔业的重要生物资源，在目前水环境保护和治理中具有重要生态价值。同时，两者作为中国传统大宗淡水鱼养殖品种，具有悠久的养殖历史，养殖体量大，在中国淡水渔业中占有极其重要的经济地位。因此，对鲢鳙种质资源的有效保护和利用具有重要意义。然而，受水利设施建设、环境污染、过度捕捞等影响，鲢和鳙的野生资源受到严重冲击，近年来野生资源量呈急剧下降趋势。此外，由于成鱼个体大、繁殖周期长等特点，两种鱼的选育实施难度较大，在其养殖业中良种覆盖率较低，亲本来源对野生资源的依赖程度较大。目前，鳙尚未获得选育良种，且养殖群体正面临生长减慢、抗病力下降和遗传多样性降低等种质退化的风险。因此，开展对鲢鳙的群体种质评估，并基于群体资源开展品种改良和选育工作，有助于减少对野生资源的依赖，并为其渔业养殖的可持续发展提供保障。中国鱼类遗传育种工作开展较多，并有很多成功案例，对中国水产养殖业健康可持续发展起到重要支撑作用。其中，群体选育是开展水产动物育种最简单的方法，主要基于目标性状和表型进行逐代选择，相对省时省力，在许多环境下可获得较快遗传进展，被广泛应用于鱼类育种；且在群体选育中，通常涉及一些种群间(或群体)间的交配组合涉及。鲢和鳙在中国广泛分布，具有较多的地域种群(或群体)，可为开展其遗传改良研究提供物质基础。此外，家系选育也是鱼类遗传改良中常用的育种技术，通过建立大量家系，掌握繁殖后代的家系数和系谱关系，有利于逐代选择中的交配方案制定，可有效降低近交概率并提高选择压力。然而，鲢鳙的亲本个体大、保种成本高、构建大量家系比较困难，加之鲢鳙的产卵量大，繁殖行为基础数据匮乏，目前尚未见报道有群体或家系选育相关工作的开展。针对以上提及的实际问题，本专利技术设想借助微卫星分子标记(microsatellite)开展鲢鳙的群体遗传研究和亲子鉴定等研究。一方面，可以了解目前鲢鳙的种质资源遗传现状，为开展选育工作提供背景数据；另一方面，通过构建亲子鉴定技术，为开展家系选育提供技术支持。在过去的几十年里，对中国鲢鳙群体的野生资源的遗传多样性研究也有较多开展，如基于形态学、同工酶和分子标记等方面的遗传比较，可为开展群体选育提供基础参考；其中也有采用微卫星标记开展的群体遗传研究，但检测技术多采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，在分辨率和准确性上存在提高和改进的空间。而微卫星标记作为动物系谱鉴定常用的分子标记，在鲢鳙的亲子鉴定研究中尚未见报道；因此，筛选适合的微卫星标记并用于构建鲢鳙亲子鉴定技术具有重要的现实意义。近年来，随着分子检测技术的不断发展，对微卫星标记等位基因的分型技术也越来越精确和高效，已由传统的琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测方法，逐步发展到毛细管电泳检测技术；其中，结合应用荧光基团(FAM和HEX等)修饰引物和高密度DNA内参标记(GS500和ROX500等)开展的测序仪毛细管电泳检测技术越来越多被用于微卫星标记的分型中，具有分辨率高、准确率高、重复性好和便于高通量检测等优点。此外，随着生物试剂稳定性的不断提高，多重PCR技术的摸索和构建也越来越便利，该方法也逐渐被应用于微卫星标记的扩增中，能有效提高实验效率并降低实验成本。综合以上的考虑，该专利技术结合鳙遗传连锁图谱相关文献信息(Zhuetal.,2014)并从NCBI网站下载微卫星序列，依据不同长度区间的目的片段标准，重新设计引物，利用鲢鳙个体DNA进行PCR扩增，并通过筛选扩增效率高、多重组合和引物浓度优化等步骤摸索构建多重PCR体系，扩增效果采用2.5％琼脂糖凝胶电泳进行检验。最后，对上游引物5'端进行荧光基团修饰(FAM或HEX)，再利用鲢鳙个体DNA进行多重PCR扩增，产物通过ABI3730XL全自动DNA测序仪进行毛细管电泳检测，各位点对应个体上的等位基因条带大小通过GeneMapperv4.0软件进行读取，最终可用于群体遗传变异研究和亲子鉴定分析。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服上述不足之处，提供一种鲢鳙通用的微卫星荧光多重PCR方法，可用于两种鱼的群体遗传和亲子鉴定等研究。本专利技术的技术方案，一种鲢鳙通用微卫星荧光多重PCR的方法，首先收集收集鲢鳙鳍条样本，并采用传统酚-氯仿的方法提取基因组DNA，随后根据目的扩增片段长度差异的要求涉及引物对，选取扩增条带清晰的3组4重PCR体系，共涉及12个微卫星标记，最后对引物进行荧光修饰及扩增验证。具体过程如下：(1)鲢鳙样本采集及DNA的制备：分别收集鲢鳙鳍条样本，保存于无水乙醇中；采用传统酚-氯仿的方法提取基因组DNA，通过1.0～1.5％琼脂糖凝胶电泳检测质量和纯度，利用紫外分光光度仪测量核酸浓度，最终稀释至20～50ng/μL，并保存于0～4℃。(2)鲢鳙微卫星引物设计和筛选：基于鳙遗传连锁图谱文献信息(Zhuetal.,2014)和从NCBI下载的相关微卫星序列，根据目的扩增片段长度差异的要求，利用PrimerPremier6.0软件设计引物，并送生物公司合成。相关引物通过步骤(1)获得的DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物利用2.0～2.5％琼脂糖凝胶电泳检测，保留扩增效果好的引物对。(3)鲢鳙微卫星多重PCR摸索和优化：基于步骤(2)筛选获得的引物对，首先将扩增条带长度差异的进行两两组合进行2重PCR扩增，再依次进行3对和4对引物的组合摸索。扩增产物通过2.0～2.5％琼脂糖凝胶电泳检测，并根据扩增效果调整多重PCR体系中各引物对的浓度。最终获得扩增条带清晰的3组4重PCR体系，共涉及12个微卫星标记，各位点及其引物信息如表1所示。其中，多重PCR体系1的4个微卫星位点分别为Arsd684、Hysd61-5、Hysd9-2和Arsd549；多重PCR体系2的4个微卫星位点分别为Arsd380、Arsd443、Hysd3112-1和Arsd639；多重PCR体系3的4个微卫星位点分别为Hym435、Arsd86、Arsd291和Arsd99。(4)对引物进行荧光修饰及扩增验证：对步骤(3)所述位点的正向引物5'端进行荧光基团修饰(FAM或HEX)，并以步骤(1)获得的DNA为模板，按照步骤(3)构建的3组4重PCR体系进行PCR扩增，扩增产物经2.5％琼脂糖凝胶电泳检测合格后，进行等位基因分型。本专利技术所述鲢鳙通用的3组4重PCR体系扩增产物的2.5％琼脂糖凝胶检测结果如图1所示。其中，标注M的电泳条带为D2000DNAMarker(TIANGEN)，标注1-1、1-2和1-3的电泳条带为多重PCR体系1的3个样本重复，标注2-2、2-2和2-3的电泳条带为多重PCR体系2的3个样本重复，标注3-1、3-2和3-3的电泳条带为多重PCR体系3的3个样本重复。步骤(4)中所述的多重PCR产物的分型是采用ABI3730XL全自动DNA测序仪本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鲢鳙通用微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是：首先收集收集鲢鳙鳍条样本，并采用传统酚‑氯仿的方法提取基因组DNA，随后根据目的扩增片段长度差异的要求涉及引物对，选取扩增条带清晰的3组4重PCR体系，共涉及12个微卫星标记，最后对引物进行荧光修饰及扩增验证。

【技术特征摘要】
1.一种鲢鳙通用微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是：首先收集收集鲢鳙鳍条样本，并采用传统酚-氯仿的方法提取基因组DNA，随后根据目的扩增片段长度差异的要求涉及引物对，选取扩增条带清晰的3组4重PCR体系，共涉及12个微卫星标记，最后对引物进行荧光修饰及扩增验证。2.权利要求1所述鲢鳙通用微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是所述3组4重PCR体系具体如下：体系1：包括4个微卫星位点，分别为Arsd684、Hysd61-5、Hysd9-2和Arsd549；体系2：包括4个微卫星位点，分别为Arsd380、Arsd443、Hysd3112-1和Arsd639；体系3：包括4个微卫星位点，分别为Hym435、Arsd86、Arsd291和Arsd99。3.权利要求1所述鲢鳙通用微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是所述3组4重PCR体系中采用的引物对核苷酸序列具体如下：体系1：Arsd684位点正向引物如SEQIDNO.1所示，Arsd684位点反向引物如SEQIDNO.2所示；Hysd61-5位点正向引物如SEQIDNO.3所示，Hysd61-5位点反向引物如SEQIDNO.4所示；Hysd9-2位点正向引物如SEQIDNO.5所示，Hysd9-2位点反向引物如SEQIDNO.6所示；Arsd549位点正向引物如SEQIDNO.7所示，Arsd549位点反向引物如SEQIDNO.8所示；体系2：Arsd380位点正向引物如SEQIDNO.9所示，Arsd380位点反向引物如SEQIDNO.10所示；Arsd443位点正向引物如SEQIDNO.11所示，Arsd549位点反向引物如SEQIDNO.12所示；Hysd3112-1位点正向引物如SEQIDNO.13所示，Hysd3112-1位点反向引物如SEQIDNO.14所示；Arsd639位点正向引物如SEQIDNO.15所示，Arsd639位点反向引物如SEQIDNO.16所示；体系3：Hym435位点正向引物如SEQIDNO.17所示，Hym435位点反向引物如SEQIDNO.18所示；Arsd86位点正向引物如SEQIDNO.19所示，Arsd86位点反向引物如SEQIDNO.20所示；Arsd291位点正向引物如SEQIDNO.21所示，Arsd291位点反向引物如SEQIDNO.22所示；Arsd99位点正向引物如SEQIDNO.23所示，Arsd99位点反向引物如SEQIDNO.24所示。4.如权利要求1所述鲢鳙通用微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是具体步骤如下：（1）鲢鳙样本采集及DNA的制备：分别收集鲢鳙鳍条样本，保存于无水乙醇中；采用酚-氯仿的方法提取基因组DNA，通过浓度为1.0%~1.5%琼脂糖凝胶电泳检测质量和纯度，利用紫外分光光度仪测量核酸浓度，最终稀释至20~50ng/μL，并保存于0~4℃备用；长期保持需冻存于-18~-20℃；（2）荧光修饰及PCR扩增：在权利要求3所述引物对中的正向引物5'端进行FAM或HEX荧光基团修饰，并以步骤（1）获得DNA为模板，按照权利要求2所述3组4重PCR体系进...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅建军，董在杰，朱文彬，方敏，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：江苏,32