【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及犀牛成分的分子检测领域，具体涉及一种用于鉴定白犀成分的引物探针组及实时荧光pcr检测方法。
技术介绍
1、当今社会犀牛角虽然被各国严令管控，但是其原材料及工艺品的巨大利益仍对一些不法分子有着很强的吸引力。在金钱的诱惑下，偷猎者的水平与作案手法不断提高，这对本就已经濒临灭绝的犀牛无疑是致命的打击。虽然犀牛角原材料可以通过传统的形态识别进行鉴定，但对于其制品的鉴定是个技术难题，因而造成执法部门取证难，案件的处理结果常起不到震慑作用。
2、实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr，qpcr)是在常规pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个反应进程。例如专利技术专利申请cn112029869a公开了一种用于检测犀牛源性成分的引物探针组及其应用，包括用于检测白犀牛源性成分的引物探针ⅰ、用于检测黑犀牛源性成分的引物探针ⅱ、用于检测印度犀牛源性成分的引物探针iii、用于检测苏门答腊犀牛源性成分的引物探针iv和/或用于检测爪哇犀牛源性成分的引物探针v，其中用于检测白犀成分的探针为taqman探针。
3、由于taqman探针是一种在双末端标记的水解探针，在5'加入一个荧光报告基团(fam、vic、hex、rox、cy5等)，在3'端则加入一个荧光淬灭基团(tamra、bhq等)。在探针完整时，淬灭基团可以吸收荧光基团发出的荧光信号，这时检测不到荧光信号，当扩增时两个基团分离，这时可以检测到荧光信号。在每扩增一次的同时就会检测到一个荧光信号，这就意味着荧光信号的
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种用于鉴定白犀成分的引物探针组及实时荧光pcr检测方法，以白犀cytb基因为靶标设计引物及探针，利用该引物探针组进行实时荧光pcr，具有特异性好，灵敏度高的优势。
2、为了实现上述目的，本专利技术采取如下技术方案：
3、一种用于鉴定白犀成分的引物探针组，所述引物包括上游引物f和下游引物r，所述探针为mgb探针p，所述引物及探针的核苷酸序列为：
4、上游引物f：5’—tcaggaatcccatccaacataga—3’；
5、下游引物r：5’—gggcgagtagtgctaggattagg—3’；
6、mgb探针p：5’—(fam)tcctgggaattttac(mgb)—3’。
7、一种用于鉴定白犀成分的实时荧光pcr检测方法，包括如下步骤：
8、步骤s1：提取待测样品的dna；
9、步骤s2：利用上述引物及探针对所述待测样品dna进行实时荧光pcr扩增得到cq值；
10、步骤s3：根据扩增曲线和cq值对样品进行分析：
11、若cq值小于30为阳性，即样品中含有白犀成分；
12、若cq值在30到35之间为可疑，需增加dna模板并重复实验，如果cq值减小并且有明显的扩增曲线则为阳性，即判为样品中含有白犀成分，否则为阴性。
13、优选的，所述步骤s2实时荧光pcr扩增体系为：probe qpcr master mix10μl；上游引物f浓度为10μmol/l，体积0.5μl；下游引物r浓度为10μmol/l，体积0.5μl；mgb探针p浓度为10μmol/l，体积0.5μl；ddh2o 4.5μl；dna模板4μl。
14、优选的，所述步骤s2实时荧光pcr反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火30s，35个循环。
15、本专利技术的有益效果如下：
16、本专利技术通过对比白犀、黑犀、披毛犀、苏门答腊犀、爪哇犀、印度犀、水牛、山羊及猪的cytb序列，设计了检测白犀成分的特异性引物及探针。本专利技术采用mgb探针进行实时荧光pcr，与taqman探针相比，本专利技术将3’端的淬灭基团替换为一种不发光的基团并加入了mgb分子，降低了探针设计长度进而降低设计难度，同时解决了taqman探针采用荧光和淬灭基团双末端标记导致淬灭不彻底的问题，使得荧光本底信号值大大降低，本专利技术设计的引物探针组特异性好、灵敏度高。
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1.一种用于鉴定白犀成分的引物探针组，其特征在于所述引物包括上游引物F和下游引物R，所述探针为MGB探针P，所述引物及探针的核苷酸序列为：
2.一种用于鉴定白犀成分的实时荧光PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤：
3.如权利要求2所述的用于鉴定白犀成分的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述步骤S2实时荧光PCR扩增体系为：Probe qPCR Master Mix10μl；上游引物F浓度为10μmol/L，体积0.5μl；下游引物R浓度为10μmol/L，体积0.5μl；MGB探针P浓度为10μmol/L，体积0.5μl；ddH2O 4.5μl；DNA模板4μl。
4.如权利要求2所述的用于鉴定白犀成分的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述步骤S2实时荧光PCR反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火30s，35个循环。
【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定白犀成分的引物探针组，其特征在于所述引物包括上游引物f和下游引物r，所述探针为mgb探针p，所述引物及探针的核苷酸序列为：
2.一种用于鉴定白犀成分的实时荧光pcr检测方法，其特征在于包括如下步骤：
3.如权利要求2所述的用于鉴定白犀成分的实时荧光pcr检测方法，其特征在于，所述步骤s2实时荧光pcr扩增体系为：probe qpcr master mix10...
【专利技术属性】
技术研发人员：王春阳，白素英，马跃，王震，金煜，张伟，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：
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