本发明专利技术公开了一种筛选抗猪圆环病毒病猪的CXCL13分子标记育种方法及其应用。本发明专利技术首次发现猪CXCL13基因5′调控区－1014位点碱基的不同会在体外试验中改变其启动子在接毒PCV2后的活性，并具有显著差异，可以作为猪抗猪圆环病毒病相关的分子标记。通过检测该分子标记，选择CXCL13基因5′调控区－1014位为GG型的猪只组建基础群进行育种，对于提高猪群体的抗圆环病毒病特性具有重要的意义。检测该分子标记不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。
A * * CXCL13 molecular marker breeding method for screening Porcine Circovirus Disease pigs and its application
The invention discloses a * * CXCL13 molecular marker breeding method for screening porcine circovirus - infected pigs and its application. It is the first discovery that different bases of the 5 * regulatory region 1014 of the CXCL13 gene will change the activity of its promoter after PCV2 infection in vitro, and has significant difference. * * can be used as a molecular marker for Porcine Circovirus Disease. It is of great significance to improve the pig population's characteristics of anti Circovirus Disease by detecting the molecular marker and selecting the CXCL13 gene 5 'regulatory region - 10 * 14 GG type pig. Detection of this molecular marker is not only simple and rapid, but also free from environmental impact, and can achieve early selection.
【技术实现步骤摘要】
一种筛选抗猪圆环病毒病猪的CXCL13分子标记育种方法及其应用
本专利技术涉及分子遗传学
，具体涉及一种筛选抗猪圆环病毒病猪的CXCL13分子标记育种方法及其应用。
技术介绍
猪圆环病毒(porcinecircovirus，PCV)属圆环病毒科圆环病毒属，含单股环状DNA，基因组大小约为1.7kb，分PCV1(非致病型)和PCV2(致病型)两种类型。PCV2主要感染5～15周龄的猪，引发猪圆环病毒相关疾病，主要表现为断奶后仔猪多系统衰竭综合征、呼吸道疾病综合征、猪皮炎肾炎综合征(AllanandEllis,2000；Stevensonetal.,2001)。PCV2感染机体后优先侵染淋巴组织，导致淋巴细胞减少，从而影响机体对病原体的免疫应答能力，导致机体产生免疫抑制，而且常与许多病原并发或继发感染，加重病情，严重的则会造成机体死亡。研究发现，猪在感染PCV2后的表现受遗传背景的影响。Opriessnig等人研究发现在感染PCV2后，长白猪所表现出的临床症状比杜洛克猪和大白猪更明显。同时，本研究团队前期的研究发现在感染PCV2后，大长杂交猪出现日增重减慢、体温升高、腹泻、肺脏充血、脾脏内淋巴细胞缺失等，而莱芜猪却无明显病变(Lietal.,2016)。以上结果表明不同品种猪对PCV2的抗性存在遗传差异，地方品种猪抗PCV2的能力较强，这就为抗猪圆环病毒病猪的育种提供了前提。分子标记辅助选择育种，是指利用DNA分子标记对育种材料进行选择，综合改良选育物种的重要性状，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法。目前，针对抗猪圆环病毒病猪的选育，人们希望通过寻找影响抗猪圆环病毒病的主效基因，进而筛选获得与抗猪圆环病毒病密切相关的分子标记，以便实现早期选种，提高育种的准确性。趋化因子是一类大小在8～14kD的趋化性细胞因子，对白细胞的激活和募集具有重要作用，是免疫系统功能的重要组成部分(MoserandLoetscher,2001；Turneretal.,2014；ZlotnikandYoshie,2000)。趋化因子配体13(CXCL13)是CXC趋化因子家族中的一员(Anseletal.,2002)，主要在巨噬细胞和树突状细胞内表达(Anseletal.,2002；AllenandCyster,2008)。CXCL13有助于生发中心的形成(Katakaietal.,2003；vandePavertetal.,2009)，吸引B细胞至次级淋巴组织，并能促进抗体产生(Manzoetal.,2008；Shietal.,2001)。此外，CXCL13能促进成骨细胞增殖(Lisignolietal.,2006)，并抑制B细胞凋亡(Munoz-Fernandezetal.,2012)。敲除CXCL13后，会导致外周淋巴结缺失(Anseletal.,2002)，天然抗体产生受阻(Anseletal.,2002)，进而导致机体产生免疫抑制。近来研究发现，当受到病原体DNA模拟物刺激后，大蒲莲猪CXCL13mRNA的表达量显著高于长白猪(Huetal.,2016)。这提示CXCL13可能与猪的抗病性相关，但CXCL13的置信区间较大，在此区间内仍然无法确定其关键的变异位点，仍然难以直接应用于猪的改良育种。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种筛选抗猪圆环病毒病猪的CXCL13分子标记育种方法及其应用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种与抗猪圆环病毒病相关的分子标记，所述分子标记为SEQIDNO.13所示的核苷酸序列第519位碱基G或A。SEQIDNO.13所示的核苷酸序列上第519位位点上由A到G的突变会提高猪抗猪圆环病毒病的能力。本专利技术的第二方面，提供一组用于检测上述分子标记的引物，所述引物的序列分别如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示。本专利技术的第三方面，提供一种用于检测上述分子标记的试剂盒，包含：上述的引物。本专利技术的第四方面，提供上述分子标记、引物或试剂盒在抗猪圆环病毒病猪的选育中的应用。本专利技术的第五方面，提供一种猪育种方法，所述方法包括：种猪选育CXCL13基因5′调控区－1014位点的GG基因型个体，淘汰CXCL13基因5′调控区－1014位点的GA基因型和AA基因型个体。上述育种方法中，GG基因型个体的抗猪圆环病毒病的能力显著高于AA基因型个体和GA基因型个体。本专利技术的第六方面，提供一种用于猪育种的检测方法，所述检测方法包括检测猪CXCL13基因5′调控区－1014位点核苷酸为G还是A，来确定基因型，然后通过基因型确定猪的生产性状，其中，所述猪的生产性状为抗猪圆环病毒病能力的高低。上述检测方法中，检测猪CXCL13基因5′调控区－1014位点核苷酸为G还是A采用的方法为：提取待测猪的基因组DNA，以猪的基因组DNA为模板，采用SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示的引物进行扩增，测定扩增产物第519位的核苷酸类型。优选的，扩增的条件为：94℃90s；98℃20s，54℃20s，72℃72s，35个循环；72℃8min。本专利技术的有益效果：本专利技术首次发现猪CXCL135′调控区－1014位点碱基(G或A)的不同会在体外试验中改变其启动子在接毒PCV2后的活性，并具有显著差异，可以作为猪抗猪圆环病毒病相关的分子标记。通过检测该分子标记，选择CXCL13基因5′调控区-1014位为GG型的猪只组建基础群进行育种，对于提高猪群体的抗圆环病毒病特性具有重要的意义。检测该分子标记不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。附图说明图1为猪CXCL13基因在脾脏内的荧光定量PCR结果；LW-u：莱芜猪对照组；LW-i：莱芜猪攻毒组；YL-u：大长杂交猪对照组；YL-i：大长杂交猪攻毒组；**P<0.01。图2为CXCL13PF和CXCL13PR引物PCR扩增猪CXCL13启动子－3407至+79片段电泳图。图3为CXCL13F1、CXCL13F2、CXCL13F3、CXCL13F4、CXCL13F5和CXCL13PR引物扩增CXCL13启动子删除片段的电泳图；图中，自左至右分别为：扩增CXCL13启动子删除片段长度分别为2745bp、2284bp、1611bp、1168bp和668bp；M：DL10000Marker。图4为构建删除载体，转染PK15细胞荧光素酶检测结果，不同字母间表示差异显著P<0.05。图5为5′调控区－1014位点多态性的鉴定结果；其中，－1014A：CXCL13基因的5′调控区－1014位碱基为A；－1014G：CXCL13基因的5′调控区－1014位碱基为G。图6为5′调控区－1014位碱基为A或G时启动子载体的荧光素酶活性检测结果；其中，A中，pGL3-CXCL13(－3407/+79)-u为－1014位多态位点为A的启动子载体对照组；pGL3-CXCL13(－3407/+79)-i为－1014位多态位点为A的启动子载体接毒组；B中，pGL3-CXCL13(－3407/+79)G-u为－1014位多态位点为G的启动子载体对照组；pGL3-CXCL13(－3407/+79)G-i为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种与抗猪圆环病毒病相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记为SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列第519位碱基G或A。
【技术特征摘要】
1.一种与抗猪圆环病毒病相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记为SEQIDNO.13所示的核苷酸序列第519位碱基G或A。2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，SEQIDNO.13所示的核苷酸序列上第519位位点上由A到G的突变会提高猪抗猪圆环病毒病的能力。3.一组用于检测权利要求1所述分子标记的引物，其特征在于，所述引物的序列分别如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示。4.一种用于检测权利要求1所述分子标记的试剂盒，其特征在于，包含：权利要求3所述的引物。5.权利要求1或2所述的分子标记、权利要求3所述的引物或权利要求4所述的试剂盒在抗猪圆环病毒病猪的选育中的应用。6.一种猪育种方法，其特征在于，所述方法包括：种猪选育CXCL13基因5′调控区－1014位点的GG基因型个体，淘汰CXCL13基因5′调控区－1014位点的GA基因型和AA基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜运良，刘根，王岩超，隋敏敏，鹿红宇，王昌英，孙亿，康丽，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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