本发明专利技术公开了大熊猫催乳素(PRL)单克隆抗体的制备及应用，属于生物学技术领域，抗大熊猫PRL单克隆抗体第一杂交瘤细胞株11906‑14，保藏编号：CCTCC NO：C2018126；抗大熊猫PRL单克隆抗体第二杂交瘤细胞株11906‑5保藏编号：CCTCC NO：C2018127。本发明专利技术利用细胞融合技术，建立分泌抗大熊猫PRL单克隆抗体的杂交瘤细胞株，收集并纯化细胞株培养上清，获得高特异性PRL单克隆抗体，并建立高特异性的PRL单克隆抗体应用于Western Blot蛋白检测，为PRL蛋白的定位和组织表达信息，及利用PRL高特异性的单克隆抗体对PRL受体进行深入研究，为特异性配体、拮抗物、抗拮抗物的发现创造条件。同时为进一步探讨PRL分泌及基因调控，揭示生殖生理规律，提供了新的资料和思路。
【技术实现步骤摘要】
大熊猫催乳素单克隆抗体的制备及应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及大熊猫催乳素单克隆抗体的制备及应用。
技术介绍
催乳素(prolactin,PRL)是一种由垂体前叶腺嗜酸细胞分泌的蛋白质激素。主要作用为促进乳腺发育生长，刺激并维持泌乳，还有刺激卵泡LH受体生成等作用。催乳素是是含229个氨基酸多肽，分子量为26236.15的蛋白质激素。在人类研究中表明，在血中还存在着较大分子的PRL，可能是PRL的前体或几个PRLA分子的聚合体是脑垂体前叶嗜碱性细胞分泌的糖蛋白激素。另外有研究表明：促乳素分子存在许多变体，已证明垂体前叶，有一种137氨基酸的促乳素变体。变体是由于促乳素基因转录物(mRNA)替换、剪切或翻译后进行蛋白酶裂解或多聚化、二聚化、磷酸化、硫化、糖基化、脱氨化等修饰形成的，经过翻译修饰可降低催乳素的活性，同时各种动物的PRL在结构存在种间差异，不同种属的动物PRL由190～200个氨基酸组成，分子量从22000-25000不等。哺乳动物的PRL都是单链多肽，相对分子质量为23000-24000。大鼠及小鼠的PRL有197个氨基酸，人、牛及猪的PRL由199个氨基酸组成。现有序列比对分析表明，不同的哺乳动物PRL的氨基酸同源序列达60％-100％，反应了PRL序列存在种属特异性。在哺乳动物，促乳素可以通过自分泌和旁分泌，作为一种细胞因子来调节乳腺发育、促进乳汁生成、发动和维持泌乳。PRL要行使功能，必须与其受体结合，通过受体作用于靶细胞，引起靶基因的表达。PRL基因和PRLR基因的突变或敲除都会引起动物的繁殖障碍。随着研究的不断深入，发现除了垂体以外，全身许多组织都能生长PRL，这正是体现PRL生物学作用多样性的原因。目前大熊猫中催乳素的研究还存在空白。由于种属差异的原因，目前没有特异的抗大熊猫PRL特异抗体。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种抗大熊猫PRL单克隆抗体杂交瘤细胞株、抗大熊猫PRL单克隆抗体及制备方法，解决现有技术中没有特异的抗大熊猫PRL特异抗体的问题。本专利技术采用的技术方案如下：抗大熊猫PRL单克隆抗体第一杂交瘤细胞株11906-14，保藏编号：CCTCCNO:C2018126；抗大熊猫PRL单克隆抗体第二杂交瘤细胞株11906-5保藏编号：CCTCCNO:C2018127。优选的，抗大熊猫PRL单克隆抗体的所述第一杂交瘤细胞株11906-14和所述第二杂交瘤细胞株11906-5均用于产生抗大熊猫PRL单克隆抗体。优选的，抗大熊猫PRL单克隆抗体，由所述第一杂交瘤细胞株11906-14和所述第二杂交瘤细胞株11906-5产生，亚型均为IgG1。优选的，抗大熊猫PRL单克隆抗体在westernblot技术中的应用。抗大熊猫PRL单克隆抗体的制备方法，步骤如下：(1)设计大熊猫PRL特异的序列如SEQIDNO:1所示，人工合成具有SEQIDNO:1所示序列的多肽片段，并与KLH偶联，作为增强免疫原性作为生产特异性抗体的免疫原PRL-KLH；(2)将步骤(1)中所述的免疫原PRL-KLH和佐剂一起注射至小鼠腹腔免疫小鼠，多次免疫，直至血清效价达标为止；(3)采用常规方法进行细胞融合，得到杂交瘤细胞；(4)对步骤(3)得到的杂交瘤细胞进行阳性克隆的筛选，选择阳性细胞孔进行细胞克隆，通过有限稀释法得到抗大熊猫PRL单克隆抗体第一杂交瘤细胞株11906-14和第二杂交瘤细胞株11906-5，并进行亚型鉴定；(5)对步骤(4)中所得的第一杂交瘤细胞株11906-14和第二杂交瘤细胞株11906-5大量培养，收集细胞培养的上清液，纯化并浓缩得到特异性抗大熊猫PRL单克隆抗体。综上所述，由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：本专利技术建立高特异性的PRL亚基单克隆抗体,应用于WesternBlot蛋白印迹检测，为PRL蛋白的定位和组织表达信息，及利用PRL高特异性的单克隆抗体对PRL受体和靶细胞的研究，探讨PRL在大熊猫上生物学作用的多样性以及PRL及其受体的调控作用，为特异性配体、拮抗物、抗拮抗物的发现创造条件。同时为进一步探讨PRL分泌及基因调控，揭示其在大熊猫繁育期的作用，提供了新的资料和思路。本申请的技术方案中：抗大熊猫PRL单克隆抗体第一杂交瘤细胞株11906-14，保藏编号：CCTCCNO:C2018126；抗大熊猫PRL单克隆抗体第二杂交瘤细胞株11906-5保藏编号：CCTCCNO:C2018127，均于2018年5月31日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行保藏，地址：中国武汉武汉大学。附图说明图1为实施例2中组织蛋白浓度的标准曲线图；图2为实施例2中Western-blot检测结果。具体实施方式本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。特异性抗大熊猫PRL单克隆抗体的制备方法，具有以下步骤：1)特异多肽片段的设计与合成：根据大熊猫PRL蛋白序列(NP_001291863.1)，参考其它物种序列分析，设计了大熊猫PRL特异的序列SEQIDNO:1所示:IVGQVHPGVRENEVYSVW，人工合成这段特异的多肽片段，并与KLH偶联，增强免疫原性作为生产特异性抗体的免疫原(PRL-KLH)，此部分委托上海生工生物公司完成。2)小鼠免疫：用佐剂：抗原＝1:1(偶联多肽PRL-KLH)的混合液，乳化完全后，腹腔注射。首次免疫佐剂为弗氏完全佐剂，后续免疫佐剂为弗氏不完全佐剂，首次免疫小鼠之前,尾部采取小鼠血液,分离血清，作为阴性对照。多次免疫，直至血清效价达标为止。3)细胞融合：包括常规方法进行细胞融合(包括SP2细胞的准备，饲养层细胞制备，脾细胞的制备)、HAT选择性培养以及ELISA法筛选，得到杂交瘤细胞。4)对上述得到的杂交瘤细胞进行阳性克隆的筛选，选择阳性细胞孔进行细胞克隆，通过有限稀释法得到抗大熊猫PRL单克隆抗体杂交瘤细胞株11906-14和11906-5，并进行亚型鉴定。5)得到的特异性抗大熊猫PRL单克隆抗体杂交瘤细胞株大量培养，收集细胞培养上清，纯化并浓缩得到特异性抗大熊猫PRL单克隆抗体。抗大熊猫PRL单克隆抗体在westernblot技术的应用，具有以下步骤：(1)目的蛋白表达组织总蛋白的提取：成年大熊猫垂体组织总蛋白的提取，蛋白提取试剂盒：C510004-0020，生工生物工程(上海)股份有限公司，所有操作步骤按试剂盒说明书进行。(2)垂体组织总蛋白浓度的测定：BCA试剂盒，C503021-0500，生工生物工程(上海)股份有限公司，所有操作步骤按试剂盒说明书进行。(3)Westernblot检测应用：按常规Westernblot技术方案进行，首先目的蛋白电泳分离，然后转膜，封闭，再进行抗大熊猫PRL单克隆抗体孵育和二抗Peroxidase-conjugatedAffiniPureGoatAnti-MouseIgG(H+L)孵育，最后进行ECL曝光。实施例11.抗大熊猫PRL单克隆抗体的制备1.1特异多肽片段的设计与合成：根据NCBI数据库大熊猫PRL氨基酸序列，登录号：NP_001291863.1，序列为：MDKKGWSLKGSLLPLLLLVSDLLLCQSVASL本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.抗大熊猫PRL单克隆抗体第一杂交瘤细胞株11906‑14，保藏编号：CCTCC NO:C2018126；抗大熊猫PRL单克隆抗体第二杂交瘤细胞株11906‑5保藏编号：CCTCC NO:C2018127。
【技术特征摘要】
1.抗大熊猫PRL单克隆抗体第一杂交瘤细胞株11906-14，保藏编号：CCTCCNO:C2018126；抗大熊猫PRL单克隆抗体第二杂交瘤细胞株11906-5保藏编号：CCTCCNO:C2018127。2.权利要求1所述的抗大熊猫PRL单克隆抗体的所述第一杂交瘤细胞株11906-14和所述第二杂交瘤细胞株11906-5均用于产生抗大熊猫PRL单克隆抗体。3.抗大熊猫PRL单克隆抗体，其特征在于，由所述第一杂交瘤细胞株11906-14和所述第二杂交瘤细胞株11906-5产生，亚型均为IgG1。4.权利要求3所述抗大熊猫PRL单克隆抗体在westernblot技术中的应用。5.抗大熊猫PRL单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤如下：(1)设计大熊猫PRL特异的序列如SE...
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡开来，侯蓉，张志和，王涓，张梦诗，刘玉良，
申请(专利权)人：成都大熊猫繁育研究基地，
类型：发明
国别省市：四川,51
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