本发明专利技术涉及一种抗树鼩CD8分子单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用，属于分子生物学技术领域。该杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心建株，保藏名称为杂交瘤细胞株TSCD8α‑C16，保藏号为CCTCC NO：C201877，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。本发明专利技术的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势，可用于检测天然树鼩淋巴细胞表面CD8分子，具有较好的灵敏度和特异性。
Monoclonal antibody against tree shrew CD8 and hybridoma cell line secreting this antibody and its application
The invention relates to a monoclonal antibody against tree shrew CD8 molecule and a hybridoma cell line secreting the antibody and its application, belonging to the technical field of molecular biology. The hybridoma cell line is deposited in the China Typical Culture Preservation Center. The preservation name is TSCD8alpha C16. The preservation number is CCTCC NO: C201877. The preservation address is No. 299, Bayi Road, Wuhan District, Wuhan City, Hubei Province. The monoclonal antibody secreted by the hybridoma cell line of the present invention has the advantages of high effective value, good specificity and strong affinity with natural antigen, and can be used to detect CD8 molecules on the lymphocyte surface of natural tree shrew, with good sensitivity and specificity.
【技术实现步骤摘要】
抗树鼩CD8分子单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用
本专利技术属于分子生物学
，涉及一个单克隆抗体，具体涉及产生特异性抗树鼩CD8分子抗体的杂交瘤细胞株和抗树鼩CD8分子抗体，以及所述抗体的应用。
技术介绍
树鼩（treeshrew,Tupaiabelangeri）是一种生活在热带和亚热带地区的哺乳纲攀鼩类的小型动物，形态酷似松鼠，是灵长类动物的近亲。由于树鼩具有体型小，经济易得，易驯养，繁殖能力强，饲养管理成本低、对人类病毒易感等优点，常常用于替代或减少一些非人灵长类动物的使用，所以很早就被用作灵长类目（包括人类）的疾病动物模型。近年来研究发现，在丙型肝炎、乙型肝炎、手足口疾病、肝癌、糖尿病、肿瘤等疾病的研究中得到广泛的应用。CD8分子作为TCR的辅受体参与对MHC分子递呈抗原的识别，CD8+T细胞能识别MHCⅠ类分子递呈的抗原，CD8+T细胞与MHC分子的相互作用能加强MHC分子和TCR之间结合的亲和力。CD8分子在哺乳动物免疫防御中起重要作用，CD8+T细胞的数量指标是衡量机体细胞免疫情况的重要指标。但目前对树鼩CD8分子方面的研究鲜有报道，且无可用的抗体来检测树鼩的CD8分子水平，对树鼩动物模型通过淋巴细胞表面分子检测分析其细胞免疫情况的评价尚属空白，严重阻碍了树鼩这一动物模型的研究和应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种抗树鼩CD8分子单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用，本专利技术的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势，可用于检测天然树鼩淋巴细胞表面CD8分子。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种分泌抗树鼩CD8分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心建株，保藏名称为杂交瘤细胞株TSCD8α-C16，保藏号为CCTCCNO：C201877，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。本专利技术还提供一种由上述的杂交瘤细胞分泌的抗树鼩CD8分子单克隆抗体。本专利技术同时提供上述抗树鼩CD8分子单克隆抗体在制备天然树鼩淋巴细胞表面CD8分子检测试剂或试剂盒中的应用。进一步，本专利技术提供一种天然树鼩淋巴细胞表面CD8分子的flowcytometry检测试剂，所述的试剂包括用Cy5.5荧光素标记的抗树鼩CD8分子单克隆抗体。进一步，本专利技术提供一种天然树鼩淋巴细胞表面CD8分子的western-blot检测试剂，所述的试剂包括辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗树鼩CD8分子单克隆抗体。本专利技术单克隆抗体除了能特异性识别淋巴细胞中的CD8分子，也可以识别树鼩脾脏中的CD8分子，这种作用证明此单抗可识别树鼩体内不同的组织中的CD8分子。本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：本专利技术的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势，可用于检测天然树鼩淋巴细胞表面CD8分子。基于此建立的检测抗体，在流式细胞分析实验中能有效识别树鼩淋巴细胞表面的天然构象的CD8分子，具有较好的灵敏度和特异性。数量为106个的外周血淋巴细胞，使用Cy5.5标记的上述CD8单克隆抗体可以检测到树鼩淋巴细胞表面CD8+的细胞百分比约为24.6%。基于此建立的树鼩CD8蛋白的western-blot检测试剂，可用于分析树鼩脾脏CD8分子的表达情况，应用上述CD8单克隆抗体，可以检测到10µg的树鼩脾脏裂解蛋白样品中清晰的CD8分子免疫印迹条带。该单抗存在抗体交叉反应，除了识别树鼩CD8分子，还可以识别小鼠和猴外周血PBMC中的CD8分子，具体参见图3。附图说明图1为树鼩CD8α重组蛋白GST-TSCD8α的表达SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白分子量Marker，1为pGEX-5X-TSCD8α诱导表达前总蛋白，2为pGEX-5X-TSCD8α诱导表达后超声上清总蛋白；图2为单克隆抗体MAb-TSCD8α-C16识别重组蛋白GST-TSCD8α的western-blot图，其中M为蛋白分子量Marker，1为GST-TSCD8α纯化蛋白样品图3为单克隆抗体MAb-TSCD8α-C16识别天然CD8蛋白的western-blot图，其中1为10µg树鼩脾脏裂解蛋白样品，2为10µg小鼠PBMC裂解蛋白；3为10µg猴PBMC裂解蛋白。图4为Cy5.5标记的单克隆抗体MAb-TSCD8-C16识别树鼩淋巴细胞表面CD8分子的流式细胞分析图，其中，a为外周血单个核细胞（PBMC）阴性对照；b为PBMC刺激后的CD8+的淋巴细胞。本专利技术杂交瘤细胞株TSCD8α-C16，已于2018年4月1日保藏于中国典型培养物保藏中心建株，保藏号为CCTCCNO：C201877，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。本专利技术除非另有说明，否则百分号代表体积百分数，比例代表体积比。一、杂交瘤细胞株的建立：（1.1）原核表达载体pGEX-5X-TSCD8α的构建根据EuropeanNucleotideArchive上发表的树鼩CD8α序列（ELV10794.1），及表达载体pGEX-5X-1的多克隆位点，设计包含EcoRI和XhoI酶切位点的引物（CD8aF和CD8aR）用以扩增树鼩CD8α序列。从树鼩尾静脉采集外周血后，用淋巴细胞分离液（购买自AXIS-SHIELD）分离得到PBMC，经TRIZOL(天根)提取总RNA，并经逆转录PCR（购买自宝生物）得到树鼩CD8α分子的编码基因片段，用T4连接酶（购买自宝生物）连接到表达载体pGEX-5X-1后，送华大基因测序鉴定正确，得到GST标签重组蛋白表达质粒pGEX-5X-TSCD8α。其中树鼩CD8α分子的DNA序列如SEQIDNO.1所示。CD8aF:ccggaattctgctcctggctctaccagc；（SEQIDNO.2）CD8aR:ccgctcgagtcacctagggcatttgcaga。（SEQIDNO.3）（1.2）重组蛋白GST-TSCD8α的表达和纯化将质粒pGEX-5X-TSCD8α转化入原核表达宿主菌BL21进行重组蛋白诱导表达，由于常规诱导表达条件不能获得以可溶形式存在的GST-TSCD8α，经过多次条件摸索，确定了LB培养基加1%葡萄糖，IPTG终浓度1mM，20℃诱导表达3小时的培养条件，可以获得以可溶形式存在的重组蛋白GST-TSCD8α。以上述条件诱导表达后的菌液经8000转离心10分钟弃上清收集菌体，用亲和纯化的结合缓冲液（亲和纯化的结合缓冲液配方如下：NaCl8.2g，KCl0.2g，Na2HPO4-12H2O3.58g，KH2PO40.25g，DTT1.54g，pH7.3，蒸馏水定容至1L，0.45µm滤膜过滤，4℃保存，DTT购自sigma，其余试剂为国产分析纯试剂）重悬菌体并进行超声破碎，超声破碎后以12000转离心20分钟，上清液本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分泌抗树鼩CD8分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心建株，保藏名称为杂交瘤细胞株TSCD8α‑C16，保藏号为CCTCC NO：C201877，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。
【技术特征摘要】
1.一种分泌抗树鼩CD8分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心建株，保藏名称为杂交瘤细胞株TSCD8α-C16，保藏号为CCTCCNO：C201877，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。2.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌的抗树鼩CD8分子单克隆抗体。3.权利要求2所述的抗树鼩CD8分子单克隆抗体在制备...
【专利技术属性】
技术研发人员：董少忠，张雪梅，吴忠香，徐婧雯，朱文兵，蒋曦，宋杰，李慧，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53
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