本发明专利技术属于抗体工程领域，具体涉及一株能稳定分泌抗芋螺毒素（ω‑CTX MVIIA）的单克隆抗体细胞株及应用。该杂交瘤细胞株2E5，已于2018年1月31日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号是：CGMCC NO.15295。本发明专利技术以原核表达纯化GST‑ω‑CTX MVIIA重组抗原为免疫抗原，TRX‑ω‑CTX MVIIA重组抗原为检测抗原包被酶标板。通过iELISA法筛选获得一株阳性杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体为建立ω‑CTX MVIIA免疫检测方法奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
一株能稳定分泌抗芋螺毒素的单克隆抗体细胞株及应用
本专利技术属于细胞工程领域，具体涉及一株能稳定分泌抗芋螺毒素（ω-CTXMVIIA）单克隆抗体的杂交瘤细胞株（IgG）及其应用。
技术介绍
芋螺毒素（Conotoxin，CTX）是芋螺（Conesnails）分泌的用于捕食和防御的一种具有生物活性的小分子多肽类神经毒素，一般含有10~30个氨基酸，大多富含二硫键，靶定神经系统的离子通道和受体，人和动物被叮咬后一般会出现麻痹、抽搐、惊厥甚至死亡。ω-芋螺毒素MVIIA（ω-CTXMVIIA）含有25个氨基酸残基，是特异与可逆的N-型电压敏感性钙离子通道的阻断剂，可当做镇痛剂治疗剧烈的和慢性的疼痛。是神经生物学、药物药理学、多肽化学、分子生物学等领域的研究热点，因此对其检测有重要意义。目前芋螺毒素的检测方法有高效液相色谱法(Highperformanceliquidchromatography,HPLC)、电喷雾-四极杆-飞行时间质谱法（Electrosprayionization/quadrupoletimeofflightmassspectrometry，ESI-Qq-TOF-MS）、铜螯合纳米磁珠结合生物质谱法（Matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry，MALDI-TOF-MS）等。这些方法具有比较高的灵敏度，可以精确的分析样品中毒素的含量，但是其设备昂贵、对样品的纯度要求高、操作复杂、需要经过专业培训的人员操作，因此不适合推广。免疫分析法（immuno-analysis）是近十多年来发展起来的新方法，是将抗原抗体反应与灵敏的检测系统结合而成的一种分析方法，具有特异性好，灵敏度高，操作技术简单，成本低，对样品的纯度要求不高等优点，特别适合于大批量样本的检测，近年来被广泛普及应用于各种毒素的检测。所以，近十几年来用于生物毒素检测的酶联免疫吸附法（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA）方法得到迅速发展。由于ω-CTXMVIIA是小分子多肽，具有抗原性但不具有免疫原性，直接免疫动物无法获得相应的抗体，因此较少看到ω-CTXMVIIA的免疫学检测方法。只有基于多克隆抗体、单链抗体和单克隆抗体（IgM）的ω-CTXMVIIA免疫检测方法，而未见基于单克隆抗体（IgG）的ω-CTXMVIIA免疫分析。因此，制备出能稳定分泌抗ω-CTXMVIIA的单克隆抗体（IgG）杂交瘤细胞株，为商品化开发生产高质量的酶联检测试剂盒奠定坚实的基础。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一株能稳定分泌抗ω-CTXMVIIA单克隆抗体（IgG）的杂交瘤细胞株。本专利技术首先保护一株杂交瘤细胞株2E5，分类命名为抗芋螺毒素（ω-CTXMVIIA）单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2018年1月31日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号是:CGMCCNO.15295。其次保护一种由所述杂交瘤细胞株2E5产生的单克隆抗体（IgG）。所述的单克隆抗体的制备方法，是将杂交瘤细胞株2E5，通过制备腹水和纯化，获得单克隆抗体（IgG）。本专利技术还保护了所述杂交瘤细胞株2E5产生的单克隆抗体的应用，是将杂交瘤细胞株2E5产生的单克隆抗体（IgG）用于检测ω-CTXMVIIA。所述杂交瘤细胞株2E5产生的单克隆抗体的应用，是将所述的单克隆抗体配制在检测ω-CTXMVIIA的免疫试剂盒中。所述的杂交瘤细胞2E5产生的单克隆抗体的制备方法是：ω-CTX为小分子肽类毒素，仅由24-29个氨基酸组成，为半抗原。若直接以其进行动物免疫，无法产生免疫效果。因此表达纯化芋螺毒素与谷胱甘肽巯基转移酶（GST）的重组蛋白GST-ω-CTXMVIIA，作为小鼠免疫用抗原；同时还表达纯化了芋螺毒素与硫氧还蛋白（TRX）的重组蛋白TRX-ω-CTXMVIIA，作为检测用抗原。小鼠免疫后，将血清效价达到1：106的小鼠脾细胞与SP2/0用50%PEG1450按照常规方法进行融合；用含20%胎牛血清的HATRPMI-1640培养基筛选融合细胞，用融合表达的抗原包被酶标板进行ELISA检测；将阳性孔细胞进行多次有限稀释法克隆化后获得可稳定分泌抗ω-CTXMVIIA单克隆抗体的杂交瘤细胞株2E5。将此细胞株以1×106/只的量注射到用液体石蜡预致敏过的Balb/c小鼠的腹腔中，一周后观察小鼠，待小鼠服部明显膨大且腹腔皮肤有紧张感时抽取腹水（腹水中含大量的杂交瘤细胞株2E5分泌的单克隆抗体）。12000r/min离心30min后取上清，-20℃保存。本专利技术以原核表达纯化GST-ω-CTXMVIIA重组抗原为免疫抗原，TRX-ω-CTXMVIIA重组抗原为检测抗原包被酶标板。通过iELISA法筛选获得一株阳性杂交瘤细胞2E5，该杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体（IgG）为建立ω-CTXMVIIA免疫检测方法奠定了基础。本专利技术的优点在于：目前的检测方法存在设备昂贵、对样品的纯度要求高、操作复杂、需要经过专业培训的人员操作等缺点，因此不适合推广。而本研究使用的免疫分析法，具有特异性好，灵敏度高，操作技术简单，成本低，对样品的纯度要求不高等优点，特别适合于大批量样本的检测，并且还未有基于单克隆抗体（IgG）的ω-CTXMVIIA免疫分析的报道。附图说明图1是本专利技术重组抗原的表达与纯化电泳图。泳道M：蛋白Maker；泳道1：空载pET-32a总蛋白；泳道2：pET-32a-ctx总蛋白；泳道3-4:纯化的TRX-CTX蛋白；泳道5：空载pGEX-6P-1总蛋白；泳道6：pGEX-6P-1-ctx总蛋白；泳道7-8：纯化的GST-CTX蛋白。图2是本专利技术免疫小鼠血清效价测定。图3是本专利技术细胞融合结果。图4是本专利技术抗体纯化结果鉴定。泳道M：Maker；泳道1：腹水总蛋白；泳道2：纯化的抗-ω-CTXMVIIA单克隆抗体。图5是本专利技术杂交瘤细胞株染色体分析。图6是本专利技术单克隆抗体亲和力检测结果。图7是本专利技术单克隆抗体间接iELISA特异性分析结果。图8是本专利技术单克隆抗体间接竞争icELISA特异性分析结果。图9是本专利技术单克隆抗体间接竞争ELISA标准检测曲线图。图10是本专利技术单克隆抗体间接竞争ELISA标准检测直线图。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。本专利技术的杂交瘤细胞株2E5，分类命名为抗芋螺毒素（ω-CTXMVIIA）单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2018年1月31日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北层西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号是：CGMCCNO.15295。实施例1本专利技术单克隆抗体的制备与鉴定1、抗原载体构建1）ω-CTXMVIIA蛋白质序列及基因序列的获得在NCBI网站上查到ω-CTXMVIIA中具有功能的成熟肽区域序列为：CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKC。根据芋螺毒素成熟肽区的氨基酸序列，按照大肠杆菌的密码子偏爱性，推导出该毒素的DNA序列，在序列的两端直接加入酶切位点，化学合成之后就可直接插入到载体之中。最后本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株杂交瘤细胞株2E5，已于2018年1月31日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号是:CGMCC NO. 15295。
【技术特征摘要】
1.一株杂交瘤细胞株2E5，已于2018年1月31日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号是:CGMCCNO.15295。2.一种由权利要求1所述杂交瘤细胞株2E5产生的单克隆抗体。3.根据权利要求2所述单克隆抗体的制备方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：王荣智，钟燕芳，杨航，王俊程，汪世华，凌素美，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建,35
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