本发明专利技术公开了一种抗糖基单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株具有抑制人胃癌细胞株（MGC‑803）生长的功能。本发明专利技术还提供一种含有上述抗糖基单克隆抗体的用于诊断或者治疗肿瘤的制剂。本发明专利技术还提供一种杂交瘤细胞株产生的抗糖基单克隆抗体的制备方法。本发明专利技术通过免疫MGC‑803细胞膜，研制出了抗糖基单克隆抗体杂交瘤细胞株HS123，可以分泌相应的抗糖基单克隆抗体，具有有效的抑制多种肿瘤细胞生长的活性。
Hybridoma cell strain and its production of anti glycosyl monoclonal antibody, preparation method and preparation thereof
The invention discloses an anti-glycosyl monoclonal antibody and a hybridoma cell line secreting the monoclonal antibody. The hybridoma cell line has the function of inhibiting the growth of human gastric cancer cell line (MGC 803). The invention also provides a preparation containing the above anti-glycosyl monoclonal antibody for the diagnosis or treatment of tumors. The invention also provides a preparation method of an anti glycosyl monoclonal antibody produced by hybridoma cell lines. By immunizing MGC 803 cell membrane, the hybridoma cell line HS123 with anti-glycosyl monoclonal antibody is developed, which can secrete corresponding anti-glycosyl monoclonal antibodies, and has the activity of effectively inhibiting the growth of various tumor cells.
【技术实现步骤摘要】
杂交瘤细胞株及其产生的抗糖基单克隆抗体以及制备方法与制剂
本专利技术涉及生物医药工程
，尤其涉及杂交瘤细胞株及由其产生的抗糖基单克隆抗体，以及抗糖基单克隆抗体的制备方法，以及用于诊断或者治疗肿瘤的制剂。
技术介绍
胃癌在我国发病率和死亡率均很高。据《中国肿瘤登记年报》报道，全国胃癌发病率为36.21/10万，居恶性肿瘤第二位；其死亡率为25.88/10万，居恶性肿瘤第三位。晚期胃癌患者五年生存率不到10％，肿瘤的复发和转移是其致死的主要原因。因此，胃癌的早期诊断及控制转移发生对患者预后至关重要。临床上一般采取西医的手术、放化疗与中药结合疗法，但多药耐药的存在，使胃癌的化疗效果受到严重影响，晚期患者因癌细胞扩散而治愈率较低。基于抗体药物的靶向治疗作为新的治疗手段在肿瘤治疗中的应用越来越广泛。近两年来，国际上很多课题组都在集中精力研制治疗性单克隆抗体，筛选能够抑制肿瘤细胞生长或者具有直接杀死肿瘤细胞能力的单克隆抗体。CD20、HER2、EGRF等都是经临床确证的研制抗体药物的分子靶点。目前，临床应用的抗肿瘤抗体药物(利妥昔、曲妥珠、吉非替尼、西妥昔和贝伐珠等等)都是针对单一靶点，但是肿瘤的发生是一个多因素、多步骤的过程，从单一靶点对肿瘤治疗是远不够的。多靶点治疗策略近年特别受到关注。多靶点作用在癌症治疗中的应用十分有优势，尤其是对单靶点抑制剂产生耐药性的癌症患者。因此，筛选能抑制肿瘤细胞生长或者能应用于肿瘤诊断的单克隆抗体成为迫切需要。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，本专利技术提供一种抑制人胃癌细胞株(MGC-803)生长的抗糖基单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本专利技术还提供一种含有上述抗糖基单克隆抗体的用于诊断或者治疗肿瘤的制剂。本专利技术还提供一种杂交瘤细胞株产生的抗糖基单克隆抗体的制备方法，该方法稳定、经济、操作不繁复，所采用的免疫原是MGC-803细胞膜蛋白，相较于纯蛋白的免疫原来说所获得的抗体位点较为繁多，利于抗体广泛筛选研究。本专利技术的杂交瘤细胞株HS123于2018年4月9日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心。地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心；保藏编号：CCTCCNO.C201859。所述杂交瘤细胞株是抗糖基单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述糖基为人肿瘤细胞蛋白上的糖基。一种抗糖基单克隆抗体，是由上述的杂交瘤细胞分泌所得。所述抗糖基单克隆抗体的亚类属于IgG1，所述抗糖基单克隆抗体具有抑制人胃癌细胞株MGC-803生长的功能。一种用于诊断或者治疗肿瘤的制剂，其包含上述的抗糖基单克隆抗体。一种抗糖基单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：步骤一：人胃癌细胞株MGC-803细胞膜悬液作为免疫原的制备：1)、将对数生长期的MGC-803细胞，用1％胰蛋白酶消化细胞，收集细胞于纯化水中，用纯化水清洗细胞至少3次，制成约5×108～1×109个细胞/mL的细胞悬液；2)、将细胞悬液置于超声波仪中进行超声裂解至少20分钟(超声5秒，间隔10秒)；3)、将裂解后的细胞悬液于12000rpm，4℃条件下离心10min，收集沉淀，用纯化水复溶，获得约5×108～1×109个细胞的细胞膜/mL的细胞膜悬液，即为免疫原；步骤二：制备杂交瘤细胞株：1)、将步骤一的MGC-803细胞膜进行乳化，皮下多点注射加腹腔注射于Balb/c小鼠，每只小鼠每次注射5×107～1×108个MGC-803细胞获得的细胞膜，注射次数为3次，时间间隔为2周，第三次多点注射加腹腔注射完成的7天后，尾静脉注射5×106～1×107个MGC-803细胞；2)、取经步骤1)的免疫小鼠脾脏，研磨后获得脾细胞，取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞(4:1)用聚乙二醇4000(PEG-4000)融合，融合完成后用HAT培养基选择性培养得到杂交瘤细胞；3)、筛选阳性的杂交瘤细胞株并扩大培养；初筛采用了间接免疫荧光法(IFA)和流式细胞术法(FACs)进行，对于初筛结果用免疫印迹法(Western-blot)进行复筛，将筛选出的这株抗糖基单克隆抗体采用有限稀释法进行亚克隆；(1)、间接免疫荧光法(IFA)筛选：将MGC-803细胞铺入96孔板中，待其长满单层后，用PBS洗三次，5min/次，加入-20℃预冷的甲醇4℃下固定15min，PBS洗三次后，取50μL杂交瘤细胞上清加入孔中，37℃孵育1h，PBS洗三次，避光加入1:200稀释的荧光二抗，37℃孵育1h，PBS洗三次后晾干，在荧光显微镜下观察。(2)、流式细胞术(FACs)的方法筛选：将处于对数生长期的MGC-803细胞用1％胰酶消化，洗涤，制成5×104个细胞/mL的细胞悬液，吸取200μL/流式细胞管，相当于1×104个细胞/流式细胞管，1000r/min离心5min，弃上清，加入200μL杂交瘤细胞分泌的上清液，孵育1h后，1000r/min离心5min，用PBS洗涤后离心，重复2次，加入1:200稀释的荧光二抗，孵育30min，1000r/min离心5min，用PBS洗涤后离心，重复2次，用200μLPBS重悬细胞，在流式细胞仪中测定。(3)、免疫印迹法(Western-blot)法筛选：采用10％分离胶、4％浓缩胶，对样品(样品包括MGC-803细胞膜悬液、以及其他肿瘤细胞裂解液)进行电泳蛋白分离(恒压60V电泳20min，100V电泳60min)，电泳完毕后，取出凝胶，在去离子水中漂洗；随后，采用硝酸纤维素膜(PVDF膜)进行转印，(恒流，200mA电流转印100min)；转印结束后取出PVDF膜封闭液室温振摇封闭2h，用TBST洗5次，每次5min，加入用封闭液稀释好的单抗(即初筛的阳性株抗体)，和膜一起孵育，4℃过夜或者室温1h。用TBST洗5次，每次5min。加入1:8000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗，室温孵育1h。用TBST洗5次，每次5min。将膜转移至新鲜配制的显影液中避光放置1-3min，在暗室显影仪中显影。(4)、有限稀释法进行亚克隆：用HT培养基将阳性杂交瘤细胞吹起，取100μL进行计数，在第一列中进行倍比稀释，使之每10mL培养基中约含100个细胞；轻柔吹匀后加入铺有饲养细胞的培养板中，100μL/孔，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。约7天后数出细胞孔里的克隆数，标记并换新的培养基，待细胞铺满整个孔底的1/3～1/2时检测。经过2-3次克隆化，待96孔板所有细胞孔均为阳性时，即可进行扩大培养，定株冻存。步骤三：抗糖基单克隆抗体的制备：将步骤3)获得的阳性杂交瘤细胞株注射于Balb/c小鼠腹腔内使所述小鼠产生腹水，收集腹水；1)、取10周龄经产的Balb/c母鼠，腹腔注射灭菌降植烷(降植烷优于液体石蜡)，0.3mL/只；2)、7d后腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，1～2×106个细胞/只；3)、待小鼠腹部出现明显隆起后，用75％酒精棉球消毒下腹部皮肤，用16号针头刺入腹腔，收集腹水；4)、收集的腹水3000r/min离心10min，取上清，用玻璃棉过滤后，分装，-70℃保存；5)、待腹水再生积聚后，再次收集。步骤四：抗糖基单克隆抗体的纯化：用protein-G柱亲和纯化，得到抗糖基单克隆抗体。1)、在柱子中预先加入1mL结合缓本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种杂交瘤细胞株，其在武汉大学中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO.C201859。
【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞株，其在武汉大学中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO.C201859。2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株是能分泌抗糖基单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述糖基为人肿瘤细胞蛋白上的糖基。3.一种抗糖基单克隆抗体，其特征在于：是由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌所得。4.根据权利要求3所述的抗糖基单克隆抗体，其特征在于：所述抗糖基单克隆抗体的亚类属于IgG1，所述抗糖基单克隆抗体具有抑制MGC-803生长的功能。5.一种用于诊断或者治疗肿瘤的制剂，其特征在于：其包含权利要求3所述的抗糖基单克隆抗体。6.一种抗糖基单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：人胃癌细胞株MGC-803细胞膜悬液作为免疫原的制备；1)、将对数生长期的MGC-803细胞，用1％胰蛋白酶消化细胞，收集细胞于纯化水中，用纯化水清洗细胞至少3次，制成5×108～1×109个细胞/mL的细胞悬液；2)、将细胞悬液置于超声波仪中进行超声裂解至少20分钟，每超声5秒间隔10秒；3)、将裂解后的细胞悬液离心，收集沉淀，用纯化水复溶，获得5×108～1×109个细胞的细胞膜/mL的细胞膜悬液，即为免疫原；步骤二：进行细胞融合，研制杂交瘤细胞株：4)、将步骤一的MGC...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐恒，刘蓓一，王毅谦，陆上苏，
申请(专利权)人：南京健安医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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