一种RXRα蛋白稳定低表达的RXRα基因敲除细胞系及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物制备技术领域，特别涉及一种RXRα蛋白稳定低表达的RXRα基因敲除细胞系及其制备方法。所述细胞系为RXRα基因敲除细胞系，敲除的碱基数为非3的整数倍，细胞内RXRα蛋白表达明显下降且基因型稳定可传代，从而大大提升了RXRα蛋白低表达细胞系的稳定性，利于细胞系的稳定传代与持续培养。本发明专利技术提供了一种所述细胞系的制备方法，根据RXRα基因序列信息，设计CRISPR敲除gRNA序列，构建gRNA表达载体，体外细胞水平检测gRNA剪切活性。随后采用核转的方法，利用cas9及gRNA表达载体共转染人神经母细胞瘤的永生化细胞即SK‑N‑SH细胞，经G418药物筛选得到稳定细胞克隆，PCR及基因测序鉴定其为RXRα基因非3整数倍基因敲除的细胞克隆，得到RXRα蛋白稳定低表达的RXRα基因敲除细胞系。

A RXR alpha gene knockout cell line with stable and low expression of RXR alpha protein and its preparation method

The invention belongs to the field of biotechnology, in particular to a RXRalpha gene knockout cell line with stable and low expression of RXRalpha protein and a preparation method thereof. The cell line is a RXRalpha gene knockout cell line. The number of knockout bases is not three times as large as the integer number. The expression of RXRalpha protein in the cell decreases obviously and the genotype is stable, which greatly improves the stability of the cell line with low expression of RXRalpha protein and is conducive to the stable passage and continuous culture of the cell line. The invention provides a preparation method of the cell line. According to RXRalpha gene sequence information, CRISPR knockout gRNA sequence is designed, gRNA expression vector is constructed, and gRNA shear activity is detected at the cell level in vitro. The immortalized cells of human neuroblastoma, SK_N_SH cells, were co-transfected with cas9 and gRNA expression vectors. The stable cell clones were obtained by G418 drug screening. The clones were identified by PCR and gene sequencing as non-3-integer-fold knockout of RXRalpha gene. The stable low expression of RXRXRalpha protein was obtained. Alpha knockout cell lines.

【技术实现步骤摘要】
一种RXRα蛋白稳定低表达的RXRα基因敲除细胞系及其制备方法
本专利技术属于生物制备
，特别涉及一种RXRα蛋白稳定低表达的RXRα基因敲除细胞系。
技术介绍
RXR(HomosapiensretinoidXreceptor，人类视黄醇X受体)基因的mRNA主要有三种剪接体，分别为RXRα(NM_002957.5)，RXRβ(NM_001291920.1)，RXRγ(NM_001291921.1)。细胞内RXRα受体可与多种药物相结合，与人类很多种疾病包括但不限于肿瘤、糖尿病、神经退行性疾病、脂肪性肝炎密切相关。构建RXRα蛋白高表达与低表达细胞系，将有助于探讨与RXRα受体相关疾病发病机理以及开发针对疾病靶点的有效药物。CRISPR/Cas技术是使用一段特异性向导RNA分子(sequence-specificguideRNA)引导核酸内切酶cas9蛋白到靶点处进行切割，形成DNA双链断裂(Double-StrandedBreak,DSB)，这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制，主要包括两种途径：第一种是低保真性的非同源末端连接途径(NHEJ,Non-homologous本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种RXRα蛋白稳定低表达的RXRα基因敲除细胞系，其特征在于，该细胞系为由取自人神经母细胞瘤的永生化细胞即SK‑N‑SH细胞，经CRISPR DESIGN软件设计敲除靶位点，经基因敲除后得到的细胞克隆，基因敲除靶位点为RXRα基因第4外显子第1‑180碱基。

【技术特征摘要】
1.一种RXRα蛋白稳定低表达的RXRα基因敲除细胞系，其特征在于，该细胞系为由取自人神经母细胞瘤的永生化细胞即SK-N-SH细胞，经CRISPRDESIGN软件设计敲除靶位点，经基因敲除后得到的细胞克隆，基因敲除靶位点为RXRα基因第4外显子第1-180碱基。2.根据权利要求1所述的RXRα蛋白稳定低表达的RXRα基因敲除细胞系，其特征在于，该细胞系分别为RXR/KO-SK-N-SH-7#(或RXR/KO-SK-N-SH-35#)和RXR/KO-SK-N-SH-15#；RXR/KO-SK-N-SH-7#(或RXR/KO-SK-N-SH-35#)为RXRα等位基因敲除纯合子，RXR/KO-SK-N-SH-15#为RXRα基因双基因型敲除细胞系，分别为第61-122(62bp)和第61-122(62bp)、61-70(10bp)、114-141(28bp)碱基缺失，敲除的序列分别为SeqNo.1和SeqNo.2、SeqNo.3。3.一种根据权利要求1所述的RXRα蛋白稳定低表达的RXRα基因敲除细胞系的制备方法，其特征在于，(1)根据RXRα基因序列信息，设计CRISPR敲除gRNA，构建gRNA表达载体，将gRNA表达载体、cas9表达载体共转染PK15猪肾细胞体外细胞水平检测gRNA剪切活性；(2)采用核转的方法，gRNA表达载体与cas9表达载体共转染神经母细胞瘤细胞SK-N-SH，采用G418药物筛选得到稳定细胞克隆，PCR及基因测序鉴定其是否为RXRα基因非3整数倍碱基缺失的基因敲除细胞克隆，最终通过Westernblot鉴定其RXRα蛋白表达水平，得到基因型可稳定遗传的RXRα基因敲除细胞系。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：(1)RXRα基因敲除靶位点的设定、gRNA的设计；(2)构建gRNA表达载体；(3)gRNA剪切活性的鉴定：脂质体转染，通过T7E1酶切鉴定gRNA剪切活性；(4)RXRα基因敲除细胞系的筛选：将gRNA表达载体、cas9表达载体通过核转的方式共转染SK-N-SH神经母细胞瘤细胞，加G418进行筛选、克隆、培养；(5)RXRα基因敲除细胞系的鉴定。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)为根据RXRα基因序列，选择RXRα-a/b/c共有的exon4作为敲除位点，设计CRISPR敲除靶位点，选定的敲除靶位点为RXRα基因第4外显子第1-180的碱基，分别以RXRα基因第4外显子的第44-66(CTTCAAGCGGACGGTGCGCAAGG)、79-101(CCTGCCGCGACAACAAGGACTGC)、106-128(TTGACAAGCGGCAGCGGAACCGG)碱基设计DNAOligos引物以合成双链gRNA；应用在线软件CRISPRDESIGN设计CRISPR敲除gRNA，合成互补的DNAOligos引物。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)为gRNA载体的构建，具体方法包括：gRNA合成后，用水溶解引物成10μM，上下游各加10μL，95℃，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建清，李云秀，蒋友胜，吴东亭，彭金铃，
申请(专利权)人：深圳市疾病预防控制中心深圳市卫生检验中心，深圳市预防医学研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44