一种B群脑膜炎球菌fHBP B亚家族单克隆抗体及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种B群脑膜炎球菌fHBP B亚家族抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCC No.15782。本发明专利技术所述B群脑膜炎球菌fHBP B亚家族抗原特异性单克隆抗体，上述的细胞株制备得到。

B group meningococcal fHBP B subfamily monoclonal antibody and preparation method thereof

The present invention relates to a hybridoma cell line of monoclonal antibody against group B meningococcal fHBP B subfamily antigen, which is preserved as CGMCC No. 15782. The monoclonal antibody specific to group B meningococcal fHBP B subfamily antigen is prepared by the cell strain.

【技术实现步骤摘要】
一种B群脑膜炎球菌fHBPB亚家族单克隆抗体及其制备方法
本专利技术涉及一种单克隆抗体的制备，特别涉及一种针对B群脑膜炎球菌fHBPB亚家族抗原特异性单克隆抗体及其制备方法，所述B群脑膜炎球菌fHBPB亚家族抗原特异性单克隆抗体对fHBPB亚家族抗原有特异性免疫反应，而对B群脑膜炎球菌fHBPA亚家族抗原无交叉反应性，所述单克隆抗体可用于以fHBPA、fHBPB抗原为疫苗组份的B群脑膜炎球菌疫苗中fHBP抗原的定量和鉴定，以及质量评价。亦可将该单克隆抗体制备成药物用于治疗由B群脑膜炎球菌感染引起的脓毒败血症等相关病症。
技术介绍
B群脑膜炎奈瑟菌(NeisseriameningitidesgroupB，)，俗称B群脑膜炎球菌，能够引起流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)和败血症，该疾病具有较高的发病率和病死率。为侵袭性脑脊髓膜炎的常见血清群的一种，目前，B群脑膜炎奈瑟菌已经成为主要的流行菌株，其与A、C群脑膜炎球菌引起的病例占90％以上。区别于其他脑膜炎球菌，B群脑膜炎球菌的荚膜多糖中由于含有线性多聚唾液酸与人神经细胞粘附因子的N-乙酰神经氨酸聚合物结构类似，在人体内不具备免疫原性，且有诱发自生免疫疾病的危险，所以B群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白成为疫苗的候选抗原。其中的外膜脂蛋白2086，即LP2086，因其能够结合人H因子，下调补体激活途径的旁路途径，而使细菌逃避机体的识别与攻击而生存，现称为H因子结合蛋白(factorHbindingprotein,fHBP)。fHBP是一种几乎表达于所有脑膜炎奈瑟菌表面的特异性脂蛋白，相对分子质量29KD左右，是脑膜炎奈瑟菌重要的毒力因子和疫苗抗原，为已上市或研发中的B群脑膜炎球菌疫苗中的重要组成成份。fHBP分为两个亚家族，A亚家族和B亚家族，即fHBPA与fHBPB。基于聚类比对分析，fHBP蛋白系统发生树表明，B亚家族约占分离株的70％，A亚家族约占30％。fHBP的氨基酸序列较保守，同一亚族内91.6％～100％氨基酸相同，不同亚族最低为62.8％。本专利技术的fHBPB亚家族单克隆抗体能够对B亚家族fHBP产生特异性抗原抗体反应，在疫苗研发和生产中，用于fHBP蛋白的定性、定量、比活等质量测定及评价。以本专利技术的fHBPB亚家族特异性单克隆抗体制备成治疗性药物，可用于治疗由B群脑膜炎球菌引起的疾病
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种B群脑膜炎球菌fHBPB亚家族单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCCNo.15782。本专利技术所述杂交瘤细胞已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter,CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCCNo.15782，保藏日期2018年5月16日，分类命名为：B群脑膜炎球菌fHBPB亚家族单克隆抗体杂交瘤细胞株。本专利技术提供了所述杂交瘤细胞株在检测B群脑膜炎球菌疫苗中fHBPB亚家族抗原成份的应用。本专利技术提供了所述杂交瘤细胞株在B群脑膜炎球菌疫苗中fHBPB亚家族抗原成份的鉴别应用。本专利技术所述杂交瘤细胞株在含有fHBPB亚家族抗原B群脑膜炎球菌疫苗制备中的应用。本专利技术的另一个目的在于提供一种B群脑膜炎球菌fHBPB亚家族抗原特异性单克隆抗体。本专利技术所述的单克隆抗体，由上述的杂交瘤细胞株制备得到。本专利技术所述的单克隆抗体的制备方法，步骤如下：(1)构建、表达并纯化带有His标签的B群脑膜炎球菌fHBPB亚家族抗原。(2)动物免疫：采用纯化后的fHBP-B(His)抗原，与弗氏佐剂按一定比例混合，乳化后以100μg/只的剂量，采用多点免疫的方法进行皮下免疫BALB/c小鼠，间隔两周共免疫2次。(3)加强免疫：第二次免疫2周后，包被fHBP-B(His)抗原，检测血清效价，选择抗体滴度在10000以上的小鼠，采用尾静脉注射的方式，加强免疫20-50μgfHBP-B(His)抗原。(4)细胞融合：无菌取经加强免疫后的小鼠脾脏，将脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按照2：1-10：1的比例混合，37℃滴加50％的PEG4000进行细胞融合，室温融合5-10分钟，离心并洗去上清后，加入含HAT的DMEM培养基，于96孔细胞培养板中37℃，5％CO2培养。(5)杂交瘤细胞筛选：待细胞长至覆盖96孔板板底10％-30％面积时，进行抗体效价的测定，筛选出特异性针对B群脑膜炎球菌B亚家族fHBP的高效价单克隆抗体融合细胞株，进行细胞库的建立，并将工作细胞库进行生物保藏，保藏编号为CGMCCNo.15782。(6)单克隆抗体的制备：将工作细胞库复苏，进行细胞传代扩增培养，至培养10层细胞工厂1-5个时，待细胞长至覆盖培养皿50-80％面积以上时，进行无血清的培养，培养3-5天后，收集细胞培养上清2000ml-10000ml；或采用传代至对数生长中期的细胞进行小鼠腹腔注射，收集腹水制备腹水单克隆抗体，小鼠腹腔注射40-60只，共收集腹水80-300ml。(7)单克隆抗体的鉴定：经WB、ELISA及染色质分析等鉴定为fHBPB亚家族特异性单克隆抗体，且抗体效价高。本专利技术的另一目的在于提供单克隆抗体，采用直接使用，或进行标记后使用，用于检测fHBP抗原。本专利技术所述的单克隆抗体在fHBPB亚家族抗原鉴定中的应用。本专利技术所述的单克隆抗体在fHBPA亚家族抗原鉴定中的应用。本专利技术所述单克隆抗体在制备含有fHBPB亚家族抗原的B群脑膜炎球菌疫苗中的应用。本专利技术所述单克隆抗体在制备含有fHBPA亚家族抗原的B群脑膜炎球菌疫苗中的应用。本专利技术还提供包含上述单克隆抗体的ELISA试剂盒。本专利技术所述ELISA试剂盒中，所述单克隆抗体直接使用，或采用酶标记，荧光标记，放射性标记，或化学发光标记等方法标记后使用。进一步的所述的酶标记，为采用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记；进一步的所述的荧光标记，为采用异硫氰酸荧光素或四乙基罗丹明或镧系螯合物等荧光物质标记；进一步的所述的放射性标记，为采用125I等放射性核素标记；进一步的所述的化学发光标记，为采用三联吡啶钌等化学发光物质标记。本专利技术所述的试剂盒中，单克隆抗体可以不经过标记，而采用经过标记的其它抗小鼠抗体进行显色试验。本专利技术所述的试剂盒中，直接应用单克隆抗体进行包被。本专利技术所述的试剂盒，用于B群脑膜炎球菌疫苗中fHBP抗原成份和含量的检测。本专利技术所述的单克隆抗体在制备治疗由B群脑膜炎球菌感染引起的脓毒败血症等疾病的药物中的应用。本专利技术所述的单克隆抗体，为针对B群脑膜炎球菌fHBPB亚家族抗原的特异性单克隆抗体，以该单克隆抗体制备的试剂盒，能够用于以fHBP为疫苗成份的B群脑膜炎疫苗中fHBP抗原的鉴别、定性和定量，以评价疫苗质量和效力。所述试剂盒检测fHBP的方法为国内外首次建立的方法，其准确度和精密度高、敏感性和适用性好，作为有效的质量评价手段，能够指导B群脑膜炎疫苗研发中各工艺条件的建立和确定，能够控制B群脑膜炎球菌疫苗生产中各工艺参数，从而生产出高标准、高质量的B群脑膜炎球菌疫苗，最终保障疫苗的安全有效。附图说明图1为PCR扩增FhbpB(His)基因序列：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种B群脑膜炎球菌fHBP B亚家族抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCC No.15782。

【技术特征摘要】
1.一种B群脑膜炎球菌fHBPB亚家族抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCCNo.15782。2.一种B群脑膜炎球菌fHBPB亚家族抗原特异性单克隆抗体，由权利要求1所述的细胞株制备得到。3.权利要求2所述的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)构建、表达并纯化带有His标签的B群脑膜炎球菌fHBPB亚家族抗原，(2)动物免疫：采用纯化后的fHBP-B(His)抗原，与弗氏佐剂按一定比例混合，乳化后以100μg/只的剂量，采用多点免疫的方法进行皮下免疫BALB/c小鼠，间隔两周共免疫2次，(3)加强免疫：第二次免疫2周后，包被fHBP-B(His)抗原，检测血清效价，选择抗体滴度在10000以上的小鼠，采用尾静脉注射的方式，加强免疫20-50μgfHBP-B(His)抗原，(4)细胞融合：无菌取经加强免疫后的小鼠脾脏，将脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按照2：1-10：1的比例混合，37℃滴加50％的PEG4000进行细胞融合，室温融合5-10分钟，离心并洗去上清后，加入含HAT的DMEM培养基，于96孔细胞培养板中37℃，5％CO2培养，(5)杂交瘤细胞筛选：待细胞长至覆盖96孔板板底10％-30％面积时，进行抗体效价的测定，筛选出特异性针对B群脑膜炎球菌B亚家族fHBP的高效价单克隆抗体融合细胞株，进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏桂民，龙静，纪国存，高博，郭通，冀颖，朱卫华，杜琳，
申请(专利权)人：北京智飞绿竹生物制药有限公司，重庆智飞生物制品股份有限公司，安徽智飞龙科马生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11