高抗癌活性T细胞的筛选方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种高抗癌活性T细胞的筛选方法，包括以下步骤：提供分离的人外周血单个核细胞；提供CD25抗体包被磁珠；检测CD3和CD25双阳性细胞的比例；使用CD25抗体包被磁珠来筛选去掉CD25阳性细胞，得到目标细胞亚群。本发明专利技术首次采用CD25抗体包被磁珠来负筛选具有高抗癌活性的T细胞特定亚群，简便易操作，成本低，便于得到离体生长情况好、再刺激扩增性强、肿瘤杀伤能力高且持久的高品质细胞免疫产品。本发明专利技术还提供了该筛选方法在免疫细胞治疗中的应用。

【技术实现步骤摘要】
高抗癌活性T细胞的筛选方法和应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种高抗癌活性T细胞的筛选方法和应用。
技术介绍
免疫细胞疗法是一种新兴的肿瘤治疗模式，已经成为全球的研究热点，特别是以肿瘤浸润细胞(TIL)、CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)/TCR-T(嵌合型T细胞)技术为主要代表，成为全球生物医学的主要发展方向。免疫细胞疗法是运用生物技术和生物制剂从患者体内分离免疫细胞进行体外培养、激活和扩增后，回输到患者体内，直接杀伤或激发机体免疫反应来杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤目的。现有的细胞免疫疗法均使用未经筛选的外周血单个核细胞(PBMC)进行培养扩增，以此法得到的未经筛选的PBMC，含有包括免疫细胞疗法所需要的杀伤性T细胞，以及免疫细胞疗法不需要的NK细胞、巨噬细胞等。同时，杀伤性T细胞又可根据其表型分为幼稚型、中枢记忆型、效应记忆型、效应型等多个表型，其形态功能、扩增性、细胞因子分泌能力等均有很大差别。换言之，未经筛选的外周血单个核细胞中只有幼稚型、中枢记忆型T细胞才适合生产免疫细胞产品(此类细胞可称为“目标细胞亚群”)，而不加筛选的使用单个核细胞进行生产不仅会导致人力、物力成本上升，而且无用的细胞亚群还有可能影响目标细胞亚群的功能，从而导致免疫细胞产品的质量下降。因此，有必要提供一种生产成本低，且能高效筛选出高抗癌活性的目标T细胞的方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种高抗癌活性T细胞的筛选方法，旨在解决现有技术中免疫细胞中无用细胞亚群多、目标细胞亚群少且活性低、质量差的问题。第一方面，本专利技术提供了一种高抗癌活性T细胞的筛选方法，包括以下步骤：(1)提供CD25抗体包被磁珠；提供分离的人外周血单个核细胞；(2)检测CD3和CD25双阳性细胞的比例：将步骤(1)中分离出的人外周血单个核细胞重悬在X-VIVO15无血清培养基中，得到第一细胞重悬液；向所述第一细胞重悬液中加入第一荧光染料标记的鼠抗人CD25抗体与第二荧光染料标记的鼠抗人CD3抗体，孵育15-50min，采用流式细胞仪检测所述孵育后的细胞中CD3与CD25双阳性细胞的百分比；(3)使用CD25抗体包被磁珠筛选CD25阴性目标细胞亚群：将步骤(1)中分离出的人外周血单个核细胞，采用X-VIVO15无血清培养基重悬，得到第二细胞重悬液；根据所述CD3和CD25双阳性细胞的比例，将所述CD25抗体包被磁珠按照与双阳性细胞的个数比为(2-5):1的比例加入到所述第二细胞重悬液中，混匀后，置于细胞培养箱中培养40-60min；将所得培养混合液在施加磁场的情况下静置，吸出上清液，并撤去磁场；向所得上清液中加入X-VIVO15无血清培养基重悬，得到含CD25阴性目标细胞亚群的悬浮液，即，含高抗癌活性T细胞的悬浮液。目前通用的T细胞表型分类指标是CCR7，CD62L，以及CD45RA/RO，还没有将CD25作为负筛选T细胞表型分类指标。本申请的专利技术人，在使用细胞免疫疗法的过程中，发现表达CD25+的T细胞(例如CD4+CD25+)会在经抗原、通过TCR的信号通路被活化后，抑制免疫反应和维持机体的耐受，还会抑制其他CD4+或CD8+正常T细胞的活化，影响它们的高抗癌活性。因此，需要去除掉这部分CD25阳性T细胞，减少这部分细胞对高抗癌活性T细胞的负面影响。本申请中，根据分离的人外周血单个核细胞重悬液中CD3与CD25双阳性细胞的百分比，来加入CD25抗体包被磁珠进行筛选，将CD25阳性的T细胞全部筛选出来并去除掉，而保留CD25阴性的T细胞作为目标细胞群，这样可以使所得到的CD25阴性T细胞的T细胞信号通路不会被抑制，T细胞离体扩增不受影响，还可以在抗肿瘤时更好的发挥激活动能，从而达到强效持久的抗肿瘤效果。之后可以再对筛选得到的目标细胞群进行离体培养。该方法可以大大减少非目标细胞的干扰，降低生产成本。本申请的步骤(3)中，在将所得培养混合液在施加磁场的情况下静置后，所得下层沉淀为需要丢弃的CD25阳性细胞，所得上清液中含有所需要的CD25阴性目标细胞。本申请中，每100mL的志愿者血样中大约可分离出(0.5-2)×108个PBMC细胞。优选地，所述第一细胞重悬液的浓度为(0.5-3)×107个/100μL。优选地，所述第一荧光染料与第二荧光染料的发射光不重合，以便区分开来。进一步优选地，所述第一荧光染料为别藻蓝蛋白(APC)、藻红蛋白(PE：Phycoerythrin)或藻红蛋白-菁类染料7(PE-Cy7)，其发红光。所述第二荧光染料为异硫氰酸荧光素(FITC)，其发绿光。优选地，所述分离的人外周血单个核细胞中呈现CD3阳性的细胞比例≥50％。进一步地，若分离的人外周血单个核细胞中呈现CD3阳性的细胞比例小于50％(例如30％)，这说明含有较少的T细胞(一般来说，几乎所有的T细胞都是CD3阳性的)，则向所述分离的人外周血单个核细胞中，加入CD3免疫磁珠富集得到CD3阳性的T细胞，之后再进行步骤(2)和(3)。优选地，步骤(3)中，所述培养是在37℃、5％CO2的条件下进行。优选地，所述CD25抗体包被磁珠是采用以下方法制得：a、将负载磁珠采用pH为6.0-10.0的第一缓冲溶液进行洗涤、重悬，向重悬后的负载磁珠中加入抗人CD25抗体，在18-37℃下避光孵育16-24h；向所得避光孵育液中加入封闭剂，以封闭掉磁珠上未结合抗体的位点，之后再孵育10-30min，得到含CD25抗体包被磁珠的反应液；b、对所述反应液静置，弃去上清液，对所得CD25抗体包被磁珠采用第二缓冲溶液进行清洗数次，并重悬于所述第二缓冲溶液，得到纯化后的CD25抗体包被磁珠，其中，所述第二缓冲溶液为含有牛血清白蛋白(BSA)和EDTA(乙二胺四乙酸)的pH＝7.0-8.0的磷酸盐缓冲液。可以理解的是，步骤(a)中，对所述负载磁珠的洗涤，可以是将装有负载磁珠、第一缓冲溶液的容器(例如试管、锥形瓶等)置于有磁场的环境中(如磁力架或磁铁上)静置，弃去上清液，得到洗涤后的磁珠。重悬时是将装有洗涤后磁珠的容器离开磁力架或磁铁提供的所述磁场环境，然后加入重悬溶液。对含CD25抗体包被磁珠的反应液的洗涤、重悬与之类似。首先将所述反应液的溶液置于磁场环境中，弃去上清液，得到含CD25抗体包被磁珠；然后撤去磁场环境，加入所述第二缓冲溶液混匀，实现包被磁珠的清洗。优选地，在采用所述第二缓冲溶液清洗时，在加入第二缓冲溶液后，先室温孵育3-5min。本申请中，所述负载磁珠是未连接抗体的普通磁珠。优选地，所述负载磁珠包括粒径为1nm-500μm的普通磁珠。进一步优选成粒径为100nm-300μm。更优选为5-100μm。在本专利技术一实施方式中，所述负载磁珠为M-450Epoxy可负载型磁珠，其粒径为为2-10μm。还可以为其他普通磁珠，并不限于M-450Epoxy磁珠。该M-450Epoxy负载磁珠为pH呈中性的亲水性磁珠，为无孔单分散超顺磁微珠，表面修饰有缩水甘油醚，该磁珠在溶液中有很强的运动能力，使偶联至磁珠的抗体可与细胞悬浮液持续进行相互作用。当置于磁场中时，微珠会轻轻地将靶细胞牵引至管壁。，可以轻松快速地倒出或吸走包含非靶细胞的上清液。在本专利技术一实施方式中，所述第一缓冲溶液为pH＝7本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高抗癌活性T细胞的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提供CD25抗体包被磁珠；提供分离的人外周血单个核细胞；(2)检测CD3和CD25双阳性细胞的比例：将步骤(1)中分离出的人外周血单个核细胞重悬在X‑VIVO 15无血清培养基中，得到第一细胞重悬液；向所述第一细胞重悬液中加入第一荧光染料标记的鼠抗人CD25抗体与第二荧光染料标记的鼠抗人CD3抗体，孵育15‑50min，采用流式细胞仪检测所述孵育后的细胞中CD3与CD25双阳性细胞的百分比；(3)使用CD25抗体包被磁珠筛选CD25阴性目标细胞亚群：将步骤(1)中分离出的人外周血单个核细胞，采用X‑VIVO 15无血清培养基重悬，得到第二细胞重悬液；根据所述CD3和CD25双阳性细胞的比例，将所述CD25抗体包被磁珠按照与双阳性细胞个数比为(2‑5):1的比例加入到所述第二细胞重悬液中，混匀后，置于细胞培养箱中培养40‑60min；将所得培养混合液在施加磁场的情况下静置，吸出上清液，并撤去磁场；向所得上清液中加入X‑VIVO 15无血清培养基重悬，得到含CD25阴性目标细胞亚群的悬浮液，即，含高抗癌活性T细胞的悬浮液。

【技术特征摘要】
1.一种高抗癌活性T细胞的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提供CD25抗体包被磁珠；提供分离的人外周血单个核细胞；(2)检测CD3和CD25双阳性细胞的比例：将步骤(1)中分离出的人外周血单个核细胞重悬在X-VIVO15无血清培养基中，得到第一细胞重悬液；向所述第一细胞重悬液中加入第一荧光染料标记的鼠抗人CD25抗体与第二荧光染料标记的鼠抗人CD3抗体，孵育15-50min，采用流式细胞仪检测所述孵育后的细胞中CD3与CD25双阳性细胞的百分比；(3)使用CD25抗体包被磁珠筛选CD25阴性目标细胞亚群：将步骤(1)中分离出的人外周血单个核细胞，采用X-VIVO15无血清培养基重悬，得到第二细胞重悬液；根据所述CD3和CD25双阳性细胞的比例，将所述CD25抗体包被磁珠按照与双阳性细胞个数比为(2-5):1的比例加入到所述第二细胞重悬液中，混匀后，置于细胞培养箱中培养40-60min；将所得培养混合液在施加磁场的情况下静置，吸出上清液，并撤去磁场；向所得上清液中加入X-VIVO15无血清培养基重悬，得到含CD25阴性目标细胞亚群的悬浮液，即，含高抗癌活性T细胞的悬浮液。2.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，分离的人外周血单个核细胞中CD3阳性的细胞比例≥50％。3.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，若分离的人外周血单个核细胞中CD3阳性的细胞比例小于50％，则：向所述分离的人外周血单个核细胞中，加入CD3免疫磁珠富集得到CD3阳性的T细胞，之后再进行步骤(2)和(3)。4.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：张长风，
申请(专利权)人：深圳宾德生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44