肿瘤浸润淋巴细胞TIL的体外扩增方法技术

本发明专利技术公开了肿瘤浸润淋巴细胞TIL的体外扩增方法，步骤为：步骤S1、TIL细胞分离：取癌旁组织剪碎浸入胶原酶溶液消化，过滤，PBS冲洗，收集滤液，离心，弃上清，加入PBS制成细胞悬液，用淋巴细胞分离液作不连续密度梯度离心，离心结束后收取下层界面的淋巴细胞，经PBS清洗后，按1×10

Amplification of tumor infiltrating lymphocytes TIL in vitro

The present invention discloses a method for in vitro expansion of TIL of tumor infiltrating lymphocyte. The steps are as follows: separation of TIL cells; digestion of collagenase solution, filtration, PBS washing, collection of filtrate, centrifugation, discarding supernatant, adding PBS to make cell suspension, and discontinuous density gradient separation with lymphocyte separating liquid. After the centrifugation, the lymphocyte collected from the lower interface was cleaned by PBS and pressed at 1 x 10.

【技术实现步骤摘要】
肿瘤浸润淋巴细胞TIL的体外扩增方法
本专利技术属于生物领域，涉及一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法。
技术介绍
免疫治疗是新兴的一种肿瘤治疗方式，已经被列为继手术、放疗、化疗后的第四种治疗方式，在肿瘤的综合治疗中逐渐发挥重要作用。2010年，美国FDA批准世界上第一个细胞免疫治疗产品Provenge上市，充分显示出细胞免疫治疗在肿瘤治疗中的价值。肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltratinglymphocyte，TIL)是存在于肿瘤间质内的以淋巴细胞为主的异质性淋巴细胞群体，大多聚集在肿瘤周围或其间质呈套状围绕癌巢。其主要成分是存在于肿瘤间质内的T淋巴细胞，小部分为MHC非限制性的NK细胞，其共同特征为表达T细胞受体(Tcellreceptor，TCR)。TIL来自肿瘤组织区域，可特异识别自体肿瘤，具有特异的MHC限制性溶解肿瘤活性。美国NCI的Rosenberg等首次证实，从实体瘤组织分离的TIL在体外经IL-2激活并大量扩增后，可用于晚期黑色素瘤患者的治疗，其治疗效果远远高于之前发展的LAK(lymphokineactivatedkillercells)细胞治疗技术(文献：Expansionofhumantumorinfiltratinglymphocytesforuseinimmunotherapytrials.JImmunolMethods1987)。近年发表的多篇临床试验报道显示，TIL细胞免疫治疗可治愈20％～40％晚期黑色素瘤，充分显示出TIL作为细胞免疫治疗手段在肿瘤治疗中的潜力(文献：Anewapproachtotheadoptiveimmunotherapyofcancerwithtumor-infiltratinglymphocytes.Science1986)。但是，目前体外扩增TIL的方法存在两点不足：第一，扩增效率不高，限制了肿瘤患者TIL的大量回输使用；第二，对肿瘤细胞的杀伤力还有待提高，回输肿瘤患者体内后对肿瘤的杀伤力不足。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术不足，提供一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法，一方面提高TIL细胞的扩增效率，另一方面提高其对肿瘤细胞的杀伤力。本专利技术技术方案如下：一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法，正式培养前使用含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和呋喃天竺葵酮A或呋喃天竺葵酮B的培养基孵育24h。优选地，具体步骤为：步骤S1、TIL细胞分离取癌症患者手术切除的新鲜癌旁组织浸泡于PBS中，剔除周围的血块、脂肪及坏死组织，PBS清洗一遍，剪成1mm3大小，浸入0.1μg/mL的IV型胶原酶溶液中，37℃水浴消化2h。消化完毕后用100μm孔径的网筛过滤，用PBS冲洗组织块，收集滤液。细胞滤液在常温下离心，1500r/min×5min。弃上清，加入PBS制成细胞悬液后，用淋巴细胞分离液作不连续密度梯度离心。离心结束后收取下层界面的淋巴细胞，经PBS清洗后，按1×106/mL的浓度悬浮于含10％人AB型血清和IL-2的X-VIVO-15培养基内，接种于12孔板上，3mL/孔，置于37℃、5％CO2培养箱内培养，每3～5d换液一次。步骤S2、培养和扩增当孔里的淋巴细胞生长至1×107时，将其转入含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和呋喃天竺葵酮A或呋喃天竺葵酮B的培养瓶内孵育，孵育24h后加入IL-2，置于37℃、5％CO2培养箱内连续培养，培养过程中每隔2～3d半量更换含同等浓度IL-2的新鲜X-VIVO-15培养基，培养22～25d后收获体外扩增的TIL。优选地，步骤S1中IL-2的浓度为2000IU/mL。优选地，抗CD3单抗浓度为20ng/mL。优选地，抗CD28单抗浓度为20ng/mL。优选地，呋喃天竺葵酮A或呋喃天竺葵酮B的浓度为20μg/mL。优选地，步骤S2中IL-2的浓度为4000IU/mL。一种用于体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的培养基，通过在X-VIVO-15培养基中添加20μg/mL的呋喃天竺葵酮A或呋喃天竺葵酮B配制而成。优选地，还含有20ng/mL的抗CD3单抗。优选地，还含有20ng/mL的抗CD28单抗。一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法，正式培养前使用含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和益智仁萜二醇A或益智仁萜二醇B的培养基孵育24h。优选地，具体步骤为：步骤S1、TIL细胞分离取癌症患者手术切除的新鲜癌旁组织浸泡于PBS中，剔除周围的血块、脂肪及坏死组织，PBS清洗一遍，剪成1mm3大小，浸入0.1μg/mL的IV型胶原酶溶液中，37℃水浴消化2h。消化完毕后用100μm孔径的网筛过滤，用PBS冲洗组织块，收集滤液。细胞滤液在常温下离心，1500r/min×5min。弃上清，加入PBS制成细胞悬液后，用淋巴细胞分离液作不连续密度梯度离心。离心结束后收取下层界面的淋巴细胞，经PBS清洗后，按1×106/mL的浓度悬浮于含10％人AB型血清和IL-2的X-VIVO-15培养基内，接种于12孔板上，3mL/孔，置于37℃、5％CO2培养箱内培养，每3～5d换液一次。步骤S2、培养和扩增当孔里的淋巴细胞生长至1×107时，将其转入含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和益智仁萜二醇A或益智仁萜二醇B的培养瓶内孵育，孵育24h后加入IL-2，置于37℃、5％CO2培养箱内连续培养，培养过程中每隔2～3d半量更换含同等浓度IL-2的新鲜X-VIVO-15培养基，培养22～25d后收获体外扩增的TIL。优选地，步骤S1中IL-2的浓度为2000IU/mL。优选地，抗CD3单抗浓度为20ng/mL。优选地，抗CD28单抗浓度为20ng/mL。优选地，益智仁萜二醇A或益智仁萜二醇B的浓度为20μg/mL。优选地，步骤S2中IL-2的浓度为4000IU/mL。一种用于体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的培养基，通过在X-VIVO-15培养基中添加20μg/mL的益智仁萜二醇A或益智仁萜二醇B配制而成。优选地，还含有20ng/mL的抗CD3单抗。优选地，还含有20ng/mL的抗CD28单抗。一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法，正式培养前使用含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和曼宋酮C或曼宋酮G的培养基孵育24h。优选地，具体步骤为：步骤S1、TIL细胞分离取癌症患者手术切除的新鲜癌旁组织浸泡于PBS中，剔除周围的血块、脂肪及坏死组织，PBS清洗一遍，剪成1mm3大小，浸入0.1μg/mL的IV型胶原酶溶液中，37℃水浴消化2h。消化完毕后用100μm孔径的网筛过滤，用PBS冲洗组织块，收集滤液。细胞滤液在常温下离心，1500r/min×5min。弃上清，加入PBS制成细胞悬液后，用淋巴细胞分离液作不连续密度梯度离心。离心结束后收取下层界面的淋巴细胞，经PBS清洗后，按1×106/mL的浓度悬浮于含10％人AB型血清和IL-2的X-VIVO-15培养基内，接种于12孔板上，3mL/孔，置于37℃、5％CO2培养箱内培养，每3～5d换液一次。步骤S2、培养和扩增当孔里的淋巴细胞生长至1×107时，将其转入含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和曼宋酮C或曼宋酮G的培养瓶内孵育，孵育24h后加入IL-2，置于37℃、5％CO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法，其特征在于：正式培养前使用含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和曼宋酮C或曼宋酮G的培养基孵育24h。

【技术特征摘要】
1.一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法，其特征在于：正式培养前使用含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和曼宋酮C或曼宋酮G的培养基孵育24h。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤为：步骤S1、TIL细胞分离取癌症患者手术切除的新鲜癌旁组织浸泡于PBS中，剔除周围的血块、脂肪及坏死组织，PBS清洗一遍，剪成1mm3大小，浸入0.1μg/mL的IV型胶原酶溶液中，37℃水浴消化2h。消化完毕后用100μm孔径的网筛过滤，用PBS冲洗组织块，收集滤液。细胞滤液在常温下离心，1500r/min×5min。弃上清，加入PBS制成细胞悬液后，用淋巴细胞分离液作不连续密度梯度离心。离心结束后收取下层界面的淋巴细胞，经PBS清洗后，按1×106/mL的浓度悬浮于含10％人AB型血清和IL-2的X-VIVO-15培养基内，接种于12孔板上，3mL/孔，置于37℃、5％CO2培养箱内培养，每3～5d换液一次。步骤S2、培养和扩增当孔里的淋巴细胞生长至1×107时，将其转入含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和曼宋酮C或曼宋...

【专利技术属性】
技术研发人员：何英广，马思航，
申请(专利权)人：淮安诺康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32