一种高效扩增NK细胞的方法技术

本发明专利技术涉及细胞培养技术领域，本发明专利技术的培养方法培养的NK细胞纯度高，数量大。本发明专利技术通过主要通过环孢素A、氢化可的松、IL‑2、CS1单抗、IL‑2、IL‑15联合使用来实现NK细胞的活化及扩增。本发明专利技术对具体的培养方法也进行描述，包含抗体的包被、NK细胞的活化及NK的扩增。本发明专利技术避免的饲养细胞的污染并且简化了流程，最大程度的避免了污染；同时培养的NK细胞纯度高，周期短，并且获得的NK具有较高的杀伤活性。

A method for efficiently amplifying NK cells

The invention relates to the technical field of cell culture. The culture method of the present invention has high purity and large quantity of cultured NK cells. The invention realizes the activation and amplification of NK cells mainly through the combined use of cyclosporine A, hydrocortisone, IL_2, CS1 monoclonal antibody, IL_2 and IL_15. The present invention also describes specific culture methods, including antibody coating, NK cell activation and NK amplification. The invention avoids the contamination of feeding cells and simplifies the process, avoids the contamination to the greatest extent; at the same time, the cultured NK cells have high purity, short cycle, and the obtained NK cells have high killing activity.

【技术实现步骤摘要】
一种高效扩增NK细胞的方法
本专利技术涉及细胞培养
，特别涉及一种NK细胞培养组合物及其培养方法。
技术介绍
自然杀伤(NatureKiller，NK)细胞，是一种自然杀伤细胞，它是除T淋巴细胞、B淋巴细胞之外的第三类淋巴细胞。它作为人体第一道防线，能够清除病毒、细菌等有害物质，同时还可以清除衰老、病变及癌变的细胞，从而维持人体的健康。NK作为重要免疫效应细胞，不需要预先致敏即可直接杀伤病毒感染或异变的靶细胞，同时具有以下特征：1、无需特异性抗原识；2、直接杀伤靶细胞；3、不受MHC限制；4、具有较广的抗瘤谱；5、基本无不良反应。在控制癌症的发生和发展中起着非常重要的作用。其可以通过释放穿孔素/颗粒酶、ADCC效应、Fas/FasL系统及NK细胞毒因子消灭人体内的病毒、细菌以及癌细胞。过继免疫治疗已经成为肿瘤免疫治疗的主要方式之一，它主要包括特异性的TIL、TCR、CAR-T、CAR-NK和非特异性的CIK、DC、NK等。正是由于以上NK其独特的特点，其在肿瘤免疫治疗中的应用越来越受到重视。研究显示：衰老及肿瘤病人的的NK细胞数量降低而且活力也降低了。在日本，NK细胞不仅广泛用于癌症病人治疗，还应用于亚健康人群，预防癌症发生。因此，如何获得大量的NK细胞成为目前亟待解决的问题。目前，NK细胞的大量获得仍然主要是通过与X射线辐射过的K562作为饲养细胞共培养获得；或者是采用磁珠分选及流式分选。但是这些方法都有明显的缺点。使用饲养绌胞无疑引入了外源性的细胞，增加了临床应用的风险；而磁珠分选及流式分选操作繁琐，无疑增加了细胞污染的风险，并且成本也较高。因此，研发一种低风险、低成本的NK细胞培养方法称为一个亟待解决的问题。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种无需滋养细胞激活NK细胞体外扩增活性技术，解决了外源性细胞引入的问题，增加了安全性；同时在本专利技术中无需通过流式分选及磁珠分选来纯化NK细胞，简化了操作流程且大大降低了成本。本专利技术所采用的技术方案是：对从外周血中分离PBMC细胞进行活化，活化后再进行扩增培养。主要包括以下几个步骤：(1)抗体包被用PBS稀释CS1单抗，并用稀释好的单抗包被T75培养瓶，抗体包被浓度为10-60μg/mL.然后置于4℃孵育过夜或者37℃培养箱中孵育2h。(2)PBMC分离及自体血清制备使用Ficoll分离人血中的PBMC，并使用X-VIVO15培养基将PBMC的浓度调整至约1×106个/mL。同时将分离得到的血浆于56℃进行灭活30min。然后离心后取上清并于4℃储存备用。(3)NK细胞活化培养将分离后的细胞转移至包被并用PBS清洗过的培养瓶中。然后加入IL-2、氢化可的松及环孢素A，它们的终浓度约为500-1000IU/mL、10-4μM/L及50-100ng/mL。最后加入7-10％的自体血清。(4)NK细胞的扩增培养观察细胞状态，当观察到细胞的克隆团较多且较大时，将其转入新的培养瓶中，并补加已经添加IL-2及IL-15的X-VIVO15培养基，IL-2及IL-15的终浓度分别为1000-1500IU/mL和10-15ng/mL。随后进行隔天补液。使细胞浓度维持在1X106。在培养第14天后，收集的细胞即为NK细胞。作为优选，本专利技术所述步骤(1)中单抗浓度为35μg/mL。并且，本专利技术所述步骤(1)中抗体的孵育条件即可以是4℃孵育过夜，也可以是37℃孵育2h。在操作时，两者选其一。并且，本专利技术步骤(2)中的人血为人的外周血或脐血。并且，本专利技术步骤(3)中的IL-2、氢化可的松及环孢素A，它们的终浓度为1000IU/mL、10-4μM/L及80ng/mL。并且，本专利技术步骤(3)中的自体血清的浓度为10％。并且，本专利技术步骤(4)中的克隆团较大是指在10X的显微镜下观察绌胞团的直径大约1cm。并且，本专利技术步骤(4)中的新培养瓶是指未曾包被过的培养瓶并且，本专利技术步骤(4)中的IL-2及IL-15的终浓度分别为1500IU/mL和15ng/mL。与现代技术相比，本专利技术的有益结果是：(1)本专利技术NK活化及扩增所采用的CS1单抗(Elotuzumab)为美国FDA认证的可用于临床的药物，研究表明其可以活化NK细胞。而氢化可的松、环孢素A、IL-2及IL-15均是临床药物。我们采用临床药物进行NK培养安全性高，原料来源广泛。(2)本专利技术采用单抗配合临床用药对NK进行活化后，然后进行扩增就可以获得高纯度的NK细胞。与之前的技术相比，避免了磁珠筛选及流式分选等步骤。大大降低了成本，并且简化了培养流程，使得NK的培养操作简单易行。(3)本专利技术所得到的NK细胞在第14天时，NK细胞的扩增倍数高达1000倍，且NK细胞的纯度高达80％以上。且培养的NK对K562细胞的杀伤能力高于使用饲养细胞培养的NK细胞的杀伤能力。综上所述，本专利技术优化了NK细胞的培养方法，为以后的NK细胞在肿瘤治疗及预防等中的应用奠定了基础。附图说明图1为采用本专利技术培养的PBMC细胞生长示意图。图2为人外周血PBMC细胞经培养14天后的流式检测结果图3NK细胞对K562及肿瘤细胞杀伤活性分析具体实施方式下面结合实施例及对专利技术进一步说明：下述实施例是说明性的，这些实施例仅用于本专利技术而不用于限制本专利技术的保护范围。本领域技术人员可以通过借鉴本文内容，适当改进工艺参数设置。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本专利技术。本专利技术所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法；本专利技术中的试剂，如无特殊说明，均为本领域的常规试剂。实施例本实施例中从人外周血中分离培养NK细胞的细胞培养方法具体步骤如下：1.抗体包被用PBS稀释CS1单抗，并用稀释好的单抗包被T75培养瓶，抗体包被浓度为35μg/mL.然后置于4℃孵育过夜。2.PBMC分离及自体血清制备对志愿者进行采血，取外周血30mL，然后使用Ficoll分离外周血中的PBMC，并使用X-VIVO15培养基将PBMC的浓度调整至约1×106个/mL。同时将分离得到的血浆于56℃进行灭活30min。然后离心后取上清，并于4℃储存备用。3.NK细胞活化培养将分离后的细胞转移至包被并用PBS清洗过的培养瓶中。然后加入IL-2、氢化可的松及环孢素A，它们的终浓度为1000IU/mL、10-4μM/L及80ng/mL。最后加入10％的自体血清。4.NK细胞的扩增培养观察细胞状态，当观察到细胞的克隆团较多且较大时，将其转入新的培养瓶中，并补加已经添加IL-2及IL-15的X-VIVO15培养基，IL-2及IL-15的终浓度分别为1500IU/mL和15ng/mL。随后进行隔天补液，使细胞的浓度维持1X106。在培养第14天后，收集的细胞即为NK细胞。为了更好的说明，在实施例中我们设置了实验组及对照组。对照组是使用同型对照人IgG取代CS1单抗进行包被，其他培养条件一致。我们对这两组细胞进行观察及检测。检测结果如下：1.在培养的第0，9，14,18,23天对实验组和对照组细胞进行计数。结果显示：实验组细胞扩增倍数远远大于对照组：在培养14天时，实验组的细胞总数就达到2X109(见图1)，细胞总数扩增80倍；在培养第21天时本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种NK细胞培养组合物及其培养方法，其特征在于首先使用CS1单抗，氢化可的松及环孢素A对NK进行活化。活化后再进行扩增培养。主要包括以下几个步骤：(1)抗体包被用PBS稀释CS1单抗，并用稀释好的单抗包被T75培养瓶，抗体包被浓度为10‑60μg/mL.然后置于4℃孵育过夜或者37℃培养箱中孵育2h。(2)PBMC分离及自体血清制备使用Ficoll分离人血中的PBMC，并使用X‑VIVO培养基将PBMC的浓度调整至约1×106个/mL。同时将分离得到的血浆于56℃进行灭活30min。然后离心后取上清并于4℃储存备用。(3)NK细胞活化培养将分离后的细胞转移至包被并用PBS清洗过的培养瓶中。然后加入IL‑2、氢化可的松及环孢素A，它们的终浓度约为500‑1000IU/mL、10‑4μM/L及50‑100ng/mL。最后加入7‑10％的自体血清。(4)NK细胞的扩增培养观察细胞状态，当观察到细胞的克隆团较多且较大时，将其转入新的培养瓶中，并补加已经添加IL‑2及IL‑15的X‑VIVO培养基，IL‑2及IL‑15的终浓度分别为1000‑1500IU/mL和10‑15ng/mL。随后进行隔天补液。使细胞浓度维持在1X106。在培养第14天后，收集的细胞即为NK细胞。...

【技术特征摘要】
1.一种NK细胞培养组合物及其培养方法，其特征在于首先使用CS1单抗，氢化可的松及环孢素A对NK进行活化。活化后再进行扩增培养。主要包括以下几个步骤：(1)抗体包被用PBS稀释CS1单抗，并用稀释好的单抗包被T75培养瓶，抗体包被浓度为10-60μg/mL.然后置于4℃孵育过夜或者37℃培养箱中孵育2h。(2)PBMC分离及自体血清制备使用Ficoll分离人血中的PBMC，并使用X-VIVO培养基将PBMC的浓度调整至约1×106个/mL。同时将分离得到的血浆于56℃进行灭活30min。然后离心后取上清并于4℃储存备用。(3)NK细胞活化培养将分离后的细胞转移至包被并用PBS清洗过的培养瓶中。然后加入IL-2、氢化可的松及环孢素A，它们的终浓度约为500-1000IU/mL、10-4μM/L及50-100ng/mL。最后加入7-10％的自体血清。(4)NK细胞的扩增培养观察细胞状态，当观察到细胞的克隆团较多且较大时，将其转入新的培养瓶中，并补加已经添加IL-2及IL-15的X-VIVO培养基，IL-2及IL-15的终浓度分别为1000-1500IU/mL和10-15ng/mL。随后进行隔天补液。使细胞浓度维持在1X106。在培养第14天后，收集的细胞即为NK细胞。2.根据权利要求1所述的一种NK细胞培养组合物及其培养方法，其特征在于：所述步骤(1)中的CS1单抗为商品化的人源化的单克隆抗体。3.根据权利要求1所述的一种NK细胞培养组合物及其培养方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晨蔚，周春燕，
申请(专利权)人：上海尚泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31