多胺类阳离子脂质、转基因载体及其制备方法技术

技术编号:18752437 阅读:184 留言:0更新日期:2018-08-25 03:54
本发明专利技术提供一种多胺类阳离子脂质以及含有该阳离子脂质的转基因载体。本发明专利技术还公开了所述阳离子脂质和转基因载体的制备方法。本发明专利技术提供的阳离子脂质由不同长度的烃基链、苯环、三氮唑以及多胺分子组成,与辅助脂质二油酰磷脂酰乙醇胺作用后所形成的阳离子脂质体对DNA具有很好的阻滞性能,且具有较低的细胞毒性,同时具有较高的转染效率,阳离子脂质和转基因载体的制备方法简单、成熟、易于掌控。

Polyamine cationic lipids, transgenic vectors and their preparation methods

The present invention provides a polyamine cationic lipid and a transgenic carrier containing the cationic lipid. The invention also discloses the preparation method of the cationic lipids and transgenic vectors. The cationic lipids provided by the invention are composed of alkyl chains of different lengths, phenylcycles, triazoles and polyamine molecules. The cationic liposomes formed by the interaction of the cationic lipids with the auxiliary lipids, phosphatidylethanolamine, have good DNA blocking properties, low cytotoxicity, high transfection efficiency and positive effect. The preparation methods of ionic lipids and transgenic vectors are simple, mature and easy to control.

【技术实现步骤摘要】
多胺类阳离子脂质、转基因载体及其制备方法
本专利技术涉及阳离子脂质以及转基因载体,具体涉及一类同时含有烃基链、苯环、三氮唑以及多胺化合物的阳离子脂质、含该类阳离子脂质的转基因载体及其制备方法。
技术介绍
基因治疗作为最前沿的医学手段之一,已经在癌症以及艾滋病等各类重大疾病的治疗中显示出巨大的威力。在基因治疗过程中,基因载体扮演着十分重要的角色。裸露的DNA比较松散、体积较大,一般以舒展的线型螺旋形式存在,而且具有负电性,因此自身很难跨膜进入细胞,即使有少量DNA进入细胞,在到达细胞核表达之前,也很容易被细胞内的核酸酶降解。这些不利因素都使得DNA分子在不借助其它技术手段的情况下,很难进行有效地基因转染,因此发展安全有效的基因载体是基因治疗成功的前提条件。基因载体包括两大类:病毒载体和非病毒载体。病毒载体具有转染效率高、靶向性好等优点。但是潜在的免疫反应以及载量小等缺点极大地限制了其在临床中的应用。非病毒载体完全可以克服病毒载体的上述缺点,具有载量大、安全性高、结构易于修饰等优点,因此得到了研究者的广泛关注。
技术实现思路
作为各种广泛且细致的研究和实验的结果,本专利技术的专利技术人已经发现,多胺分子经不同长度烃基链修饰之后,表现出较低的细胞毒性,转染效率与烃基链的长度有很大关系:随着烃基链的增加,转染效率增加,含有不饱和键的载体转染效率高于含有饱和键的载体。基于这种发现,完成了本专利技术。本专利技术的一个目的是解决上述问题和/或缺陷,并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种具有多功能的多胺类阳离子脂质的转基因载体,不仅具有低的细胞毒性,而且同时具有较高的转染效率,以促进基因治疗的发展。本专利技术还有一个目的是提供多胺类阳离子脂质的制备方法以及含有该阳离子脂质的转基因载体的制备方法。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点,提供了一种多胺类阳离子脂质,所述阳离子脂质的结构式(1)如下:式(1)中,R1为烃基链,R2为多胺分子。其中,优选的是,R1为CH3(CH2)2CH2,CH3(CH2)6CH2,CH3(CH2)10CH2,CH3(CH2)16CH2,CH3(CH2)7CHCH(CH2)7CH2中的一种,R2为本专利技术的目的还可以进一步由多胺类阳离子脂质的制备方法来实现,该方法的合成路线如下:所述方法具体步骤包括:步骤一、按比例称取式2化合物、脂肪胺、催化剂、缩合剂和有机碱,加入溶剂溶解,在氮气氛围下反应8~10小时,反应结束后,减压浓缩,柱层析分离得到式3化合物;步骤二、所述步骤一得到的式3化合物与Boc保护的炔丙胺溶于四氢呋喃溶剂中得四氢呋喃溶液,将溶有硫酸铜和维生素C的水溶液加入所述四氢呋喃溶液中,室温下反应15~20小时,反应结束后,减压浓缩,柱层析分离所得化合物加入到氯化氢的饱和乙酸乙酯溶液中,室温搅拌反应0.5~1小时,将溶剂浓缩,真空干燥18-24小时,得到式1化合物阳离子脂质。优选的是,其中,在所述步骤一中,所述式2化合物,所述脂肪胺R1NH2化合物,所述催化剂为1-羟基苯并三唑,所述缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸与所述有机碱为三乙胺的物质的量的比为1:1:2:2:3,柱层析分离中采用的洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯,石油醚和乙酸乙酯的体积比为4:1。优选的是,其中,在所述步骤二中,所述四氢呋喃溶液中的四氢呋喃和所述水溶液中的水的体积比为2:1,所述式3化合物与所述式4化合物的摩尔比为1:2.2,所述柱层析分离中采用的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇,二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点,还提供了一类转基因载体,所述转基因载体由不同长度烃基链修饰的树枝状分子类阳离子脂质、二油酰磷脂酰乙醇胺和高纯灭菌缓冲液组成。优选的是,其中,所述阳离子脂质的摩尔浓度为1.0mM,所述阳离子脂质与所述二油酰磷脂酰乙醇胺的摩尔比为1:6。本专利技术的目的还可以进一步由转基因载体的制备方法来实现,该方法具体包括步骤:将所述阳离子脂质、二油酰磷脂酰乙醇胺与无水氯仿加入到高温灭菌的烧瓶中,溶解后减压浓缩得到脂质体膜,将所述脂质体膜真空干燥去除残留氯仿,干燥后的脂质体膜与预先预热到70℃的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液混合配成所需浓度的溶液,超声得到所述转基因载体。本专利技术的目的还可以进一步由含有不同长度烃基链的多胺类阳离子脂质的制备转基因载体中的应用来实现。本专利技术至少包括以下有益效果:1、由于本专利技术提供的阳离子脂质体的结构中含有仲胺和叔胺,在生理条件下能够部分质子化而带上正电荷,因而能够与带负电的DNA静电作用,并将DNA浓缩为适合细胞内吞的纳米颗粒;2、转基因载体细胞毒性较低,载体/DNA复合物与细胞培养后细胞存活率均大于90%;3、阳离子脂质和转基因载体的制备方法简单、成熟、易于掌控;4、转基因载体转染效率在E1和HeLa细胞中转染效率较低,低于售转基因载体Lipofectamine2000;在MG63和HEK293细胞中均超过基因载体Lipofectamine2000,其中在细胞HEK293中的转染效率为Lipofectamine2000的3倍,也就是说提供的阳离子脂质体表现出一定的细胞选择性,在不同细胞中的转染效率有较大差异,可为临床靶向治疗提供可能性;本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现,部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本专利技术的转基因载体与DNA复合物的琼脂糖凝胶电泳实验结果示意图;图2为本专利技术所述转基因载体与质粒DNA的复合物在E1、HeLa、MG63、和HEK293细胞中的细胞毒性图;图3为本专利技术所述转基因载体与质粒DNA的复合物的粒径及zeta电位;图4是本专利技术所述不同浓度的转基因载体1e与pGL-3DNA复合物在E1细胞中的转染示意图。图5是本专利技术所述转基因载体1a-1e与pGL-3DNA复合物在E1、HeLa、MG63和HEK293细胞中的转染示意图。下面结合具体实施方式和附图对本专利技术做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。具体实施方式应当理解,本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。<实例1>步骤一、按比例称取式2化合物(0.86mmol)、正丁胺化合物(0.86mmol)、1-羟基苯并三唑催化剂(1.72mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸缩合剂(1.72mmol)与三乙胺(2.58mmol),加入二氯甲烷溶剂40mL溶解,在氮气氛围下反应8~10小时,反应结束后,减压蒸掉溶剂,加入35mL水,二氯甲烷(40mLx2)萃取,合并有机相,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,去除溶剂,硅胶柱层析分离(石油醚/乙酸乙酯体积比=4/1)得白色固体得到式3a化合物,产率:89%;核磁1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.67(s,2H),7.40(s,1H),6.18(brs,1H),4.43(s,4H),3.47(dd,J=3.0,7.1Hz,2H),1.65-1.60(m,2H),1.47-1.38(m,2H),0.97(t,J=7.3Hz,3H);核磁13CNMR(1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多胺类阳离子脂质,其特征在于,所述阳离子脂质的结构式(1)如下:

【技术特征摘要】
1.一种多胺类阳离子脂质,其特征在于,所述阳离子脂质的结构式(1)如下:式(1)中,R1为烃基链,R2为多胺分子。2.根据权利要求1所述的多胺类阳离子脂质,其特征在于,R1为CH3(CH2)2CH2,CH3(CH2)6CH2,CH3(CH2)10CH2,CH3(CH2)16CH2,CH3(CH2)7CHCH(CH2)7CH2中的一种,R2为3.一种制备如权利要求1或2中所述的多胺类阳离子脂质的方法,其特征在于,所述的阳离子脂质的合成路线如下:所述方法包括:步骤一、按比例称取式2化合物、脂肪胺R1NH2、催化剂、缩合剂和有机碱,加入溶剂溶解,在氮气氛围下反应8~10小时,反应结束后,减压浓缩,柱层析分离得到式3化合物;步骤二、步骤一得到的式3化合物与Boc保护的炔丙胺式4化合物溶于四氢呋喃溶剂中得四氢呋喃溶液,将溶有硫酸铜和维生素C的水溶液加入所述四氢呋喃溶液中,室温下反应15~20小时,反应结束后,减压浓缩,柱层析分离所得化合物加入到氯化氢的饱和乙酸乙酯溶液中,室温搅拌反应0.5~1小时,将溶剂浓缩,真空干燥18~24小时,得到式1化合物阳离子脂质。4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,在所述步骤一中,所述式2化合物,所述脂肪胺R1NH2,所述催化剂为1-羟基苯并三...

【专利技术属性】
技术研发人员:高永光骞爱荣党凯田野张文娟姜山峰赵欣罗晓庆
申请(专利权)人:西北工业大学西安九清生物科技有限公司
类型:发明
国别省市:陕西,61

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