引物末端酶解二聚体法PCR制造技术

引物末端酶解二聚体法PCR，其特征是采用3'最末端第1/2个碱基均为A/a腺嘌呤结尾的引物和底物dUTP/dU代替dTTP渗入PCR产物酶解污染策略；尿嘧啶‑DNA糖基化酶UDG酶解引物二聚体的缺/脱dU产物仍是引物结合模板，引物对3'最末a配对PD产物链脱dU处既缺碱基可匹配结合又无模板可复制；无a结尾引物须变一个3'末端RNA(rN)碱基以增加RNase酶解PD污染；使用eUDG、及RNaseH‑II和内切酶III‑VIII、限制内切酶消化前次或历次PCR产物气雾胶、靶交叉污染，联用中部同序引物减少内源PD产生，PCR成分加蔗糖分层缓释并矿物油封闭，热启动、热灭活不耐热酶。

【技术实现步骤摘要】
引物末端酶解二聚体法PCR
：本专利技术属于分子生物学及分子检验的核酸扩增PCR
，具体涉及碱基修饰引物末端的酶解来限制或去除其引物二聚体PD产物非特异性污染的PCR领域。
技术介绍
：多聚酶链反应PCR背景可追溯至其历史发展源头，1953年Watson建立DNA双螺旋模型及半保留复制法则为PCR扩增奠定了其分子基础，甚至1971年Khorana就已发表了一核酸体外扩增(J.Molec.Biol.,56:341)相关论文；但限于当时技术条件不足,没有产生成熟的核酸扩增技术。直到1985年美国Cetus公司Mullis根据一端引物测序原理,想到了一对引物结合延伸-指数扩增或几何级数式放大的巨大威力,才专利技术了一对特异引物结合、复制靶分子基因,体外(于试管内)模拟天然基因半保留复制的PCR技术；再经过一系列发展和耐热聚合酶、热循环仪的专利技术、应用，Cetus公司于1987年申请了首个PCR专利技术专利(USPatent4,683,202)。扩增过程一般经靶DNA变性：加温94℃使双链解离成为单链；引物退火(复性)：降温至54℃左右使过量引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物延伸：升温至72℃左右，DNA单链模板—引物结合物在耐热DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，尊循碱基反向配对与半保留复制原理，引物末端按5'-3'方向延伸、合成一条新的与模板DNA链反向互补的半保留复制链，不断重复循环变性--退火--延伸三过程，这种新链又可成为下次循环的模板，靶分子以2n级数产生更多的“半保留复制”新链。超级灵敏度的指数放大或几何级数放大是PCR最核心的本质或优点，靶分子以2n级数放大,常规30个热循环反应230约等于109放大倍数,扩增放大倍数似原子裂变链式反应难以想象,也是一般线性放大检测方法无可比拟的,灵敏度远远大于普通检测方法的放大倍数,近40个循环反应放大1012倍或达飞克fg/ml即个位数分子水平检测。这也是PCR成为应用最广的最核心技术甚至多少个最形容也绝不过分的根本原因。同样，指数放大亦带来PCR高度特异性和顽固的非特异性，PCR特异性直接来源于引物序列的特异性,一端引物序列一点非特异错配扩增甚至仅一侧完全配对扩增也仅是线性放大,自然远远赶不上指数扩增或几何级数放大，引物特异性任何一点降低或与靶一丁点不匹配也就扩增速率落下了,而远远赶不上特异的指数或几何级数放大；反过来说,只要是靶分子以指数扩增或几何级数放大，PCR扩增检测就具有足够高特异性。非特异性同理，各种常规检验方法遇见的非特异性原因虽也存在于PCR技术,但终究赶不上指数扩增放大，仅一条引物非特异结合线性扩增远远赶不上指数非特异性,只有一对引物均非特异结合、延伸的扩增才是唯一指数非特异性原因,引物间非特异聚合并互为模板、互为引物的二聚体PrimerDimer(PD)指数扩增是PCR非特异性本质,也是其难以克服的根本原因,一般3'末端数个碱基连续反向互补的引物对于不加模板的本底PCR扩增反应中约几个—十几个循环处即出现引物二聚体PD扩增；一对常规设计的引物对于本底PCR反应30个循环开始出现显著的PD非特异性扩增，并遮盖和抑制位于30-38循环的数千拷贝数以下的低浓度靶分子扩增检测，这也是普通PCR只进行30个循环反应的主要原因。随着PCR巨大优越性和广泛应用,其它许多PCR新方法，新改进也不断涌现,被专利技术，主要包括须PCR反应后处理/检测的终末/终点PCR和闭管分析的实时荧光定量PCR两大类。由于常规终末PCR因同样量的样本经PCR超级放大以后变化太大而产量不均一，致使难以定量检测，传统的终末/终点PCR只能PCR后凝胶电泳来区分特异与非特异扩增条带,且30个循环反应限制了低于数千拷贝测不出；1997年采用动态实时检测扩增对数期的循环数与靶初始量成反比(反对数关系)的实时荧光PCR(Real-timePCR)技术实现了从定性测定到精确定量的飞跃，扩增40个循环反应放大1012倍而可测个位数拷贝,根据发光原理不同分为荧光染料SYBRGreenⅠ实时荧光PCR和各种荧光核酸探针PCR两类(BioTechniques1997,22:130-138)。染料法实时荧光PCR通过SYBRGreenⅠ结合产物DNA双链小沟使发射荧光增强1000倍而检测，但非特异性扩增双链产物也结合发射荧光，同样30个循环后非特异扩增也遮盖了低浓度样本检测；探针法TaqMan等实时荧光PCR的靶特异探针不针对引物序列而绕开了PD非特异性产物，但引物二聚体PD扩增于探针法荧光PCR不可见并不代表其不存在、不起作用，较高的Ct30PD扩增竞争性抑制同引物的低浓度靶扩增而降低其检测灵敏度；另一方面,过量引物与探针DNA链之间也产生一定程度的非特异聚合、延伸的扩增，不加靶模板的PCR本底系统,一对引物与任意一个荧光标记TaqMan探针均产生约Ct33-35的非特异性扩增曲线，且随着反复重复同一PCR扩增,其扩增平台期荧光吸收峰值越来越高,Ct值也逐渐前移，产生一定的样本检测假阳性，假阳也无法与靶阳性区别。反而染料法荧光PCR通过融解曲线,常规PD产物特异Tm值小于77℃-78℃能区别靶产物Tm≥85℃-89℃；但一些优化引物对不易形成特定二聚体其PD产物因而不单一而无典型狭窄Tm值。指数非特异性与超敏特异性扩增是PCR相关的两个重要方面，指数特异性扩增相关研发报导一直是生物学最热门领域；但指数非特异性障碍同样限制了PCR及荧光PCR应用，其相关研究报导却不多，大多研究焦点集中于PCR热启动来克服可能的引物低温结合所致非特异扩增，措施包括蜡包Mg2+离子热释放、聚合酶Taq修饰抑制包括端N缺失的KlenTaq(NucelicAcidsRes.2003,31-21:6139),抗Taq酶抗体和Taq酶抑制寡核苷酸Aptamar(J.MolBiol.1997,271:100),以及四氧化戊烷热激活引物(NucelicAcidsRes.2008,36-20:e131)等热启动方法。但低温启动最多也仅扩增一个循环放大一倍/一次,远赶不上非特异指数放大，将无靶模板PCR反应置低温(10℃)数天PCR不增加本底Ct值,置室温(20°-40℃)启动数小时至过夜仅增加本底Ct值1-3个循环；且PCR在热变性后才手动加完全组份的绝对热启动本底Ct值也仅推后1-3个循环数；冰箱低温(＜10℃)时Taq酶无活性,低于室温Taq酶活性也很低,低温启动不是PD非特异性形成关键原因；低温退火才显著增加非特异性。试用各种控制非特异的措施如变化PCR组份、添加各种化学试剂等,其对特异与非特异扩增基本是平行的,显著抑制PCR非特异性也不同程度地干扰靶特异性扩增效率,反之不影响靶扩增效率又难以抑制PCR非特异性。引物引起的指数非特异性还是源于其碱基序列,一对完全同序引物绝没有引物非特异性。Hands技术(Homo-Tagassistednon-dimersystem,NucleicAcidsRes.Vol.25,No16:p3235-3241)采用完全同序引物Tag通过引物二聚体单链两端自身结合竞争游离引物,不仅显著抑制PD非特异性,也都没有选择地减低靶特异性扩增效率。单链结合蛋白S本文档来自技高网...

【技术保护点】
引物末端酶解二聚体法PCR，其特征是采用引物末端碱基修饰并且在PCR反应试剂混合之前进行修饰产物酶解去除污染引物二聚体的PCR技术，具体如以下方法：(1)选取3'最末端倒数第1/2个碱基或1‑2个碱基均为A/a腺嘌呤结尾设计的一对引物，底物dUTP/dU代替dTTP渗入PCR产物包括引物二聚体PD产物，通过PCR试剂成分预先加入0.2‑2％体积E.coli UDG(5U/μl,v/v)大肠杆菌尿嘧啶‑DNA糖基化酶，各成分于混合前室温RT两小时至两天—或37℃二十分钟至两小时消化前次或历次PCR产物气雾胶交叉污染，然后依次混合所述PCR试剂并加入待测纯化样本，立即PCR反应；(2)无a结尾但离末尾小于7‑8碱基或一端无a结尾一对引物均变一个3'末端RNA(rN)碱基(a之外),或一侧a结尾引物变一个3'末端rN碱基而无a结尾引物近末端变一个rN碱基，随机dU代替dT渗入PCR产物,其PCR成分预先加入0.2‑2％(v/v)eUDG+0.2‑2％(v/v)RNaseH/HII(5U/μl)和0.2‑5‰(v/v)内切酶EndIII‑VIII(10U/μl)三酶联用,成分混合前室温RT三小时至三天—或37℃半小时至三小时,彻底酶解切断PD产物污染，然后依次混合所述PCR试剂并加入待测纯化样本，尽快PCR反应；(3)最末1‑2个a结尾一对引物a之外再3'端离最末小于6‑10碱基处(嘧啶后面)变一个RNA(rN)碱基，底物dU代替dT渗入PCR产物，PCR成分预先加入0.5‑1％(v/v)eUDG单独酶解；或PCR成分预先加入1％(v/v)eUDG和0.5％RNaseH/HII(5U/μl)先行酶解37℃一小时至三小时，Taq酶中另加0.5‑1％(v/v)内切酶EndIII‑VIII(10U/μl)于PCR反应液混合后37℃不超过30分钟，程序预设三酶顺次水解，然后加样、启动PCR反应。...

【技术特征摘要】
1.引物末端酶解二聚体法PCR，其特征是采用引物末端碱基修饰并且在PCR反应试剂混合之前进行修饰产物酶解去除污染引物二聚体的PCR技术，具体如以下方法：(1)选取3'最末端倒数第1/2个碱基或1-2个碱基均为A/a腺嘌呤结尾设计的一对引物，底物dUTP/dU代替dTTP渗入PCR产物包括引物二聚体PD产物，通过PCR试剂成分预先加入0.2-2％体积E.coliUDG(5U/μl,v/v)大肠杆菌尿嘧啶-DNA糖基化酶，各成分于混合前室温RT两小时至两天—或37℃二十分钟至两小时消化前次或历次PCR产物气雾胶交叉污染，然后依次混合所述PCR试剂并加入待测纯化样本，立即PCR反应；(2)无a结尾但离末尾小于7-8碱基或一端无a结尾一对引物均变一个3'末端RNA(rN)碱基(a之外),或一侧a结尾引物变一个3'末端rN碱基而无a结尾引物近末端变一个rN碱基，随机dU代替dT渗入PCR产物,其PCR成分预先加入0.2-2％(v/v)eUDG+0.2-2％(v/v)RNaseH/HII(5U/μl)和0.2-5‰(v/v)内切酶EndIII-VIII(10U/μl)三酶联用,成分混合前室温RT三小时至三天—或37℃半小时至三小时,彻底酶解切断PD产物污染，然后依次混合所述PCR试剂并加入待测纯化样本，尽快PCR反应；(3)最末1-2个a结尾一对引物a之外再3'端离最末小于6-10碱基处(嘧啶后面)变一个RNA(rN)碱基，底物dU代替dT渗入PCR产物，PCR成分预先加入0.5-1％(v/v)eUDG单独酶解；或PCR成分预先加入1％(v/v)eUDG和0.5％RNaseH/HII(5U/μl)先行酶解37℃一小时至三小时，Taq酶中另加0.5-1％(v/v)内切酶EndIII-VIII(10U/μl)于PCR反应液混合后37℃不超过30分钟，程序预设三酶顺次水解，然后加样、启动PCR反应。2.根据权利要求1所述的引物末端酶解二聚体法PCR，其特征在于：所述上下游引物中的一条的引物中部至5'端增加变一个RNA(rN)碱基/dI碱基或烷基修饰嘌呤；对应地，所有PCR试剂成分在混合前添加UDG酶联用RNaseHII酶/hAAG酶，于物理隔绝情况下PCR以杜绝引物二聚体PD非特异性扩增。3.根据权利要求1所述的引物末端酶解二聚体法PCR，其特征在于：为防止靶分子气雾胶造成微量污染试剂，PCR试剂成分/各组分混合前还加入不影响靶扩增的稀浓度0.2％-0.5％(v/v)靶序列限制内切酶2-4种混合酶液，利用PCR成分混合前室温RT两小时至两天—或37℃二十分钟至两小时酶切消化靶模板分子交叉污染。4.根据权利要求1所述的引物末端酶解二聚体法PCR，其特征在于：PCR用水使用便宜的化学法替代酶法消化污染,新鲜纯化水采用加0.1‰-0.2‰(v/v)即万分之一、二稀释的10％次氯酸钠液室温1-2天消化污染DNA，再开盖煮沸除去次氯酸钠后加0.05‰-0.1‰(v/v)外切酶ExoIII冷藏待用。5.根据权利要求1所述的引物末端酶解二聚体法PCR，...

【专利技术属性】
技术研发人员：江洪，江雨康，
申请(专利权)人：江洪，
类型：发明
国别省市：安徽,34