一种用于检测黄连叶斑病致病菌的引物及其方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域。提出一种用于检测黄连叶斑病致病菌的引物及其方法和应用，所述的引物如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，通过基因组DNA提取，通用引物进行第一轮扩增，特异性引物进行第二轮扩增，从而检测黄连叶斑病致病菌。本发明专利技术具有检测灵敏度极高，即使在角担菌处于潜伏侵染，不表现症状的时候也能检测出病原菌的存在，最低浓度为1fg/μL；同时具有特异性强，不会被其他病原菌干扰，准确率高的特点。

Primer for detecting pathogenic bacteria of Coptis leaf spot and its method and Application

The invention belongs to the field of biological technology. The primers, methods and applications of the primers, such as SEQ ID NO:1 and SEQ ID NO:2, were used to detect the pathogen of Rhizoma Coptidis leaf spot. The primers were amplified by genomic DNA and the specific primers were amplified by the specific primers for second rounds, so as to detect the pathogen of leaf spot disease of Huanglian. The invention has high detection sensitivity and can detect the existence of pathogenic bacteria even when it is latent infection and does not show symptoms. The minimum concentration is 1fg/ mu L, and it has the characteristics of strong specificity, not being interfered by other pathogenic bacteria and high accuracy.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测黄连叶斑病致病菌的引物及其方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于检测黄连叶斑病致病菌的引物及其方法和应用。
技术介绍
黄连(CoptischinensisFranch.)又名味连、川连、鸡爪连，属毛茛科、黄连属多年生草本植物，是我国名贵的常用中药材，分布于湖北恩施、重庆石柱等地，是国家重点发展的中药材品种之一，黄连使用历史悠久。黄连作为多年生的植物，phomaaquilegiicola引起的叶斑病发生较广，干扰其光合作用，严重影响其产量。恩施州是我国黄连种植主要产区，当地黄连叶斑病发生较重，平均发病率为79％，严重田块可达100％，以及缺乏植物保护专业人才的指导，存在乱施滥用各类化学药剂的情况，不但未能有效防治病害，而且增加了致病菌的抗药性和环境污染，这些对黄连产量和品质影响较大，严重威胁黄连产业的进一步发展和壮大。传统病原菌的鉴定必须在植株表现出症状后才可以实施，需要病原菌分离、纯化培养、科赫氏法则验证、形态学观察、生理生化性状等去鉴定，顺利的话完成整个过程需要大约20天，但是一旦产生其他杂菌污染培养基，就会影响鉴别速度，同时长时间的鉴定耽误防治时机。传统鉴定存在鉴定不准、耗时、费力的缺点，完全满足不了植保工作精准、快速防控的要求。为了解决黄连叶斑病快速蔓延的现状，实现快速、精准的鉴定phomaaquilegiicola引起的黄连叶斑病的目的，急需建立一种能够实现“便捷”、“快速”与“准确”目标要求的phomaaquilegiicola引起黄连叶斑病的快速检测方法。本专利技术根据phomaaquilegiicola与同属其它微生物的ITS区域(基因转录间隔区)碱基组成差异而设计特异性引物，采用巢式PCR(NestedPCR)对phomaaquilegiicola进行分子检测，检测操作简单、准确性好、灵敏度较高，国内外均未有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测黄连叶斑病致病菌的引物，并提了黄连叶斑病致病菌巢式(Nested)PCR快速检测方法，其具有快速、精准，灵敏的特点，有效提高了检测phomaaquilegiicola引起黄连叶斑病的便捷性、及时性和准确度。本专利技术具体通过以下技术方案实现：一种用于检测黄连叶斑病致病菌的引物，所述的特异性引物根据phomaaquilegiicolaITS基因序列特异性，设计对phomaaquilegiicola具有特异扩增作用的一对PCR引物，即特异分子检测引物的序列为：上游引物HLTY1F：5`GAAGACAATTTAAACCCTTTGCAGT3`；下游引物HLTY1R：5`TTAAGGCGAGTCTACACGCAGAGGC3`；此外，本专利技术提供了一种快速、准确、操作简单的黄连叶斑病致病菌的快速检测方法，具体包括以下步骤：1)提取待测样品基因组DNA；2)利用通用引物ITS1/ITS4进行第一轮PCR扩增；所述的用引物为：ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；3)将第一轮扩增产物稀释10倍，作为模板，利用特异引物HLTY1F/HLTY1R进行第二轮PCR扩增；所述的特异引物为：HLTY1F：5`GAAGACAATTTAAACCCTTTGCAGT3`；HLTY1R：5`TTAAGGCGAGTCTACACGCAGAGGC3`；4)凝胶电泳检测，于凝胶成像系统下拍照检测，存在289bp的DNA特异性条带，则确定所检测样品中存在黄连叶斑病致病菌。进一步，所述的样品基因组利用CTAB法提取。进一步，所述的第一轮PCR扩增的反应体系为25μL：2×TaqMasterMix12.5μL，10μM的上下游引物ITS1/ITS4各1μL，DNA1μL，双蒸水9.5μL；反应程序为：预变性94℃5分钟，94℃30秒，54℃1分钟，72℃1分钟，30个循环，最后在72℃延伸3分钟，16℃保存。进一步，所述的第二轮PCR扩增的反应体系为25μL：2×TaqMasterMix12.5μL，10μM的上下游引物HLTY1F/HLTY1R各1μL，DNA模板1μL，双蒸水9.5μL；反应程序为：预变性94℃3分钟，接着94℃30秒，52℃30秒，72℃30分钟，30个循环，最后在72℃延伸3分钟，16℃保存。本专利技术还提供了所述的特异性引物HLTY1F/HLTY1R在检测黄连叶斑病致病菌中的应用，一般通过通用引物和所述的特异性引物HLTY1F/HLTY1R组成的引物组合物，进行巢式PCR扩增，在进行凝胶电泳检测来实现。另外，本专利技术还提供了一种用于检测检测黄连叶斑病致病菌的试剂盒，所述的试剂盒包含特异性引物HLTY1F/HLTY1R和通用引物ITS1/ITS4。本专利技术的有益效果为：1)本专利技术引物和方法检测灵敏度极高，可以检测到1fg/μL的phomaaquilegiicola基因组DNA，较常规PCR检测方法灵敏度提高1000倍，即使在潜伏期或者感染极其轻微的情况下也能准确检测出phomaaquilegiicola；2)本专利技术方法针对黄连叶斑病菌基因组DNA可以扩增出289bp的单一条带，特异性强，受外源基因组DNA干扰小，精准度高；3)本专利技术还有耗时短、操作简单的特点，不需要复杂的检测场所和实验室，完成整个检测程序约3个小时，常规病原菌鉴定方法至少需要20天；4)本专利技术适用于黄连引种检疫、脱毒种子种苗质量检测，以及黄连抗phomaaquilegiicola引起的叶斑病抗性鉴定早期无症状植株检测。附图说明图1是特异引物HLTY1F/HLTY1R针对phomaaquilegiicola基因组DNA的特异性检测；其中泳道1为DL2000Marker；泳道2为清水空白对照，为阴性对照；泳道3为phomaaquilegiicola基因组DNA，阳性对照；泳道4、5、6、7、8、9、10、11、12、13为稻瘟菌、丝核菌、茎点霉、炭疽菌、镰刀菌、链格孢、核盘菌、稻曲菌、白绢菌及白术基因组DNA；图2是特异引物HLTY1F/HLTY1R的常规PCR检测phomaaquilegiicola基因组DNA；其中泳道1为DL2000Marker；泳道2为清水空白对照；泳道3-11分别为phomaaquilegiicola基因组DNA依次为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL和1fg/μL；图3是特异引物HLTY1F/HLTY1R的NestedPCR检测phomaaquilegiicola基因组DNA；其中泳道1为DL2000Marker；泳道2为清水空白对照；泳道3-11分别为phomaaquilegiicola基因组DNA依次为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL和1fg/μL；图4是特异引物HLTY1F/HLTY1R在NestedPCR条件下检测田间黄连叶斑病；其中泳道1为DL2000Marker；泳道2为清水空白对照；泳道3-7分别为叶斑病植株，8-12为健康无病植株。具体实施方式下面将结合本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测黄连叶斑病致病菌的引物，其特征在于，所述的引物如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测黄连叶斑病致病菌的引物，其特征在于，所述的引物如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。2.一种黄连叶斑病致病菌的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取待测样品基因组DNA；2)利用通用引物ITS1/ITS4进行第一轮PCR扩增；3)将第一轮扩增产物稀释10倍，作为模板，利用特异引物进行第二轮PCR扩增；4)凝胶电泳检测，于凝胶成像系统下拍照检测，存在289bp的DNA特异性条带，则确定所检测样品中存在黄连叶斑病致病菌。3.根据权利要求2所述的一种黄连叶斑病致病菌的快速检测方法，其特征在于，所述的样品基因组利用CTAB法提取。4.根据权利要求2所述的一种黄连叶斑病致病菌的快速检测方法，其特征在于，所述的通用引物如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示。5.根据权利要求2所述的一种黄连叶斑病致病菌的快速检测方法，其特征在于，所述的特异性引物如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。6.根据权利要求2所述的一种黄连叶斑病致病菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：游景茂，郭杰，熊坤，郭晓亮，朱志贤，段媛媛，邹宗成，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院中药材研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42