利用有限核苷酸组成的引物扩增制造技术

本发明专利技术提供了一种采用单一引物或一对有限核苷酸组成的正向引物和反向引物进行扩增的方法。有限核苷酸组成意味着该引物在至少一种核苷酸类型中是非充分的。这样的引物极大地降低了相互引发的能力，或者降低了在目标核酸的靶引物结合位点以外的地方的错引而引起的延伸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用有限核苷酸组成的引物扩增相关申请的交叉引用本申请是非临时的，要求于2015年4月24日提交的美国专利62/152,756的优先权，所述申请的全部内容通过引用并入本文。PCR扩增是由KaryMullis在1983年专利技术的(Mullis,1987U.S.PatentNo.4,683,202；Saikietal.,1985,Science(NewYork,N.Y.),230(4732),1350–1354)，KaryMullis因此获得了诺贝尔奖。自那以后，出现了多种基于引物的模板依赖型核酸扩增方法，其中包括链置换方法(GeorgeT.Walker,Little,&Nadeau,1993,U.S.Pat.No.5,270,184；GeorgeT.Walker,1995,U.S.Pat.No.5,455,166；G.T.Walkeretal.,1992,nucleicacidsResearch,20(7),1691–1696,1992,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,89(1),392–396)以及基于转录的扩增系统，包括US.Pat.Nos.5437990、5409818和399491中描述的方法；转录扩增系统(TSA)(Kwohetal.,1989,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,86(4),1173–1177；Kacian&Fultz,1995,U.S.Pat.No.5,480,784；Kacian&Fultz,1996,U.S.Pat.No.5,399,491)；以及自我持续序列复制(3SR)(Fahy,Gingeras,Guatelli,Kwoh,&Whitfield,1992,WO92/08800；Guatellietal.,1990,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,87(5),1874–1878)；连接链反应(有时也称为寡核苷酸连接酶扩僧OLA)(Laffler,Carrino,&Marshall,1993,AnnalesDeBiologieClinique,51(9),821–826)；循环探针技术(CPT)(Duck,Alvarado-Urbina,Burdick,&Collier,1990a,BioTechniques,9(2),142–148),rollingcircleamplification(RCA)(Fire&Xu,1995,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,92(10),4641–4645；Lizardi,1998,U.S.Pat.No.5,854,033)；基于核酸序列的扩增(NASBA)(Compton,1991,Nature,350(6313),91–92,Malek,Davey,Henderson,&Sooknanan,1992)；有创裂解技术(HDA)(Kong,Vincent,&Xu,2004,US2004-0058378A1；Kong,Vincent,&Xu,2007USpat.US2007/0254304A1)；指数式扩增(EXPAR)(VanNess,VanNess,&Galas,2003,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,100(8),4504–4509)；杂交链反应(HCR)(R.M.Dirks&Pierce,2004,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,101(43),15275–15278,R.Dirks&Pierce,2012,U.S.Pat.No.8,105,778)；催化颈环组装(CHA)(Li,Ellington,&Chen,2011,nucleicacidsResearch,39(16),e110)。上述所有参考文献以引用的方式并入本文。尽管核酸扩增技术已经广泛应用，其并非没有缺陷，这些缺陷限制了其精度和灵敏度。目标扩增产物通常来自于一对正向引物和反向引物的延伸，正向引物和反向引物结合到其完全互补的引物结合位点。但是非目标扩增产物可能来源于引物互配(primerduplexing)，一条引物作为另一条引物(引物二聚体)的延伸模板，也可能来源于引物匹配到第二引物结合位点(非目标引物结合位点)，根据沃森克里克配对规则，发生了一定程度的错配。结果是目标扩增产物和多种非目标产物或背景产物一起被合成。当样品中意向目标物的起始浓度降低或者PCR循环次数增加时，或者当在多重扩增中使用了不止一对引物时，这些非目标产物或背景产物的存在更加明显(参考附图2和3，比较了常规引物和本专利技术的有限组成引物)。结果是，检测灵敏度受到循环范围的限制，超过循环范围可能检测到目标扩增产物信号的线性增加。减少反应启动前引物延伸产物的形成可以减少非特异性扩增。在一种被称为“热启动”过程的方法中，反应混合物中不加入一种或多种关键试剂，直到反应温度上升到足以提供必要的杂交特异性。在人工热启动方法中，在起始高温孵育步骤后，打开反应管，加入之前没有添加的试剂，这种方法劳动强度大，且增加了反应混合物污染的风险。可选地，热敏物质，例如蜡，可以用于隔离或隔绝反应组分，如Bloch,Raymond,&Read,1995US.Pat.No.5411876和Chou,Russell,Birch,Raymond,&Bloch,1992,nucleicacidsResearch,20(7),1717–1723所述，该文献以引用的方式并入本文。在这些方法中，高温预反应孵育融化了热敏物质，使得反应试剂混合。另一种减少反应启动前引物延伸产物形成的方法依赖于DNA聚合酶的热可逆失活。Birch,Laird,&Zoccoli,1997U.S.Pat.No.5677152以及Birch,Laird,&Zoccoli,1998U.S.PatNo.5773258描述了通过改性剂基团的共价结合而可逆调节的DNA聚合酶，这两篇文献以引用的方式并入本文。失活DNA聚合酶在高温下孵育会导致改性剂-酶之间的键的裂解，从而使酶复活。Scalice,Sharkey,ChristyJr.,Esders,&Daiss,1994,USPat.Nos.5338671描述了通过DNA聚合酶特异性抗体实现DNA聚合酶的非共价可逆抑制，该文献以引用的方式并入本文。根据Gelfand,Kwok,&Sninsky,1995,USPat.No.5418149描述的方法，也可以通过酶降解反应启动前形成的延伸产物来减少非特异性扩本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种扩增目标核酸的链段的方法，包括：使包含目标核酸的样品与正向和反向引物接触；以及进行扩增反应，其中所述目标核酸的扩增链段通过正向和反向引物的延伸而形成，所述目标核酸作为模板；其中所述引物在四种标准核苷酸类型中的一种或多种中是非充分的，所述引物中的非充分核苷酸类型是相同的，所述扩增片段是通过所述正向和/或反向引物的延伸而形成的主要扩增产物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.24 US 62/152,7561.一种扩增目标核酸的链段的方法，包括：使包含目标核酸的样品与正向和反向引物接触；以及进行扩增反应，其中所述目标核酸的扩增链段通过正向和反向引物的延伸而形成，所述目标核酸作为模板；其中所述引物在四种标准核苷酸类型中的一种或多种中是非充分的，所述引物中的非充分核苷酸类型是相同的，所述扩增片段是通过所述正向和/或反向引物的延伸而形成的主要扩增产物。2.如权利要求1所述的方法，其中所述目标核酸具有含有正向引物结合位点和反向引物结合位点的互补区的链。3.如权利要求1所述的方法，其中所述目标核酸具有含有正向引物结合位点和反向引物结合位点的链。4.如上述任一项权利要求所述的方法，其中所述扩增链段占由所述正向和反向引物的延伸而形成的所有扩增产物中的至少99％。5.如上述任一项权利要求所述的方法，其中所述正向和反向引物对正向和反向引物结合位点的互补性比对样品中任何其他支持扩增的引物结合位点的互补性更高。6.如上述任一项权利要求所述的方法,其中所述正向和反向引物有且仅有四种标准核苷酸类型非充分中的一种。7.如上述任一项权利要求所述的方法,其中所述正向引物结合位点和所述反向引物结合位点在所述正向和反向引物中的非充分核苷酸类型的互补核苷酸方面是非充分的。8.如上述任一项权利要求所述的方法,其中所述正向和反向引物具有不多于两个单位的非充分核苷酸类型，且所述正向引物结合位点和所述反向引物结合位点具有不多于四个单位的所述非充分核苷酸类型的互补核苷酸类型。9.如上述任一项权利要求所述的方法,其中所述正向和反向引物具有不多于一个单位的非充分核苷酸类型，且所述正向引物结合位点和所述反向引物结合位点具有不多于两个单位的所述非充分核苷酸类型的互补核苷酸类型。10.如上述任一项权利要求所述的方法,其中所述正向和反向引物中的所述非充分核苷酸类型不会占据所述正向和反向引物的3’位置。11.如上述任一项权利要求所述的方法,其中所述正向和反向引物由除了非充分核苷酸类型之外的三种核苷酸组成，且所述正向物结合位点和所述反向引物结合位点由除了所述正向和反向引物中的所述非充分核苷酸类型的互补核苷酸类型之外的三种核苷酸组成。12.如权利要求1-11任一项所述的方法，其中所述正向和反向引物在5’端具有一个单位的非充分核苷酸。13.如权利要求1所述的方法，其中所述正向和反向引物具有四种标准核苷酸类型非充分中的两种。14.如权利要求13所述的方法，其中所述正向引物结合位点和所述反向引物结合位点在所述正向和反向引物的非充分核苷酸类型的互补核苷酸类型方面是非充分的。15.如上述任一项权利要求所述的方法，其中所述正向引物结合位点和所述反向引物结合位点的互补区是连续的。16.如权利要求1-15任一项所述的方法，其中所述正向引物结合位点和所述反向引物结合位点的互补区被一段区域分隔开，该区域不含有所述正向和反向引物的非充分核苷酸类型及其互补核苷酸类型。17.如权利要求1-15任一项所述的方法，其中所述正向引物结合位点和所述反向引物结合位点的互补区被一段区域分隔开，该区域含有所述正向和反向引物的非充分核苷酸类型或其互补核苷酸类型或两者。18.如上述任一项权利要求所述的方法,其中所正向和/或反向引物的3’核苷酸与所述正向和反向引物的非充分核苷酸是互补的。19.如上述任一项权利要求所述的方法，其中所述正向和/或反向引物的3’核苷酸是C或G。20.如上述任一项权利要求所述的方法，其中所述正向和/或反向引物含有非天然核苷酸，其是肌苷,isoC,isoG,7-去氮-2'-脱氧鸟苷或7-去氮-2'-脱氧腺苷。21.如上述任一项权利要求所述的方法,其中所述正向和/或反向引物含有至少一种非天然核苷酸类型，其是肌苷、次黄嘌呤、氮杂羧胺衍生物、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、硝基咪唑、3-硝基咪唑、4-硝基吡唑、4-硝基苯并咪唑、4-氨基苯并咪唑、5-咪唑、4-5-二唑酰胺或5-硝基吲唑。22.如上述任一项权利要求所述的方法,其中所述正向和/或反向引物的5’端连接有人工寡核苷酸，所述人工寡核苷酸具有与所述正向和/或反向引物相同的非充分核苷酸类型。23.如权利要求22所述的方法，其中所述人工寡核苷酸包含非天然碱基，例如肌苷。24.如权利要求1-17,19和20任一项所述的方法，其中所述扩增是采用核苷酸三磷酸单体进行的，去除了与所述正向和反向引物的非充分核苷酸类型互补的核苷酸三磷酸单体。25.如权利要求1-23任一项所述的方法，其中所述扩增中存在全部四种标准核苷酸三磷酸单体。26.如权利要求25所述的方法，其中相对于其他的标准核苷酸三磷酸单体，所述正向和反向引物的非充分核苷酸类型的互补核苷酸三磷酸单体以更低的浓度存在。27.如权利要求25所述的方法，其中所述正向和反向引物的非充分核苷酸类型的互补核苷酸三磷酸单体以双脱氧核苷酸三磷酸提供。28.如权利要求25所述的方法，其中所述dNTPs包括7-去氮-2'-脱氧腺苷三磷酸和/或7-去氮-2'-脱氧鸟苷三磷酸。29.如上述任一项权利要求所述的方法,进一步包括搜寻目标核酸链的序列，以寻找所述正向引物结合位点和所述反向引物结合位点的互补区。30.如上述任一项权利要求所述的方法,其中所述正向引物结合位点和/或所述反向引物结合位点包括至少一个单元的正向和反向引物的非充分核苷酸类型的互补核苷酸类型，且所述引物和引物结合位点的杂交导致至少一个错配。31.如权利要求21和30所述的方法，其中所述正向和反向引物与所述引物结合位点的杂交导致引物中非天然核苷酸类型与引物结合位点的非充分核苷酸类型的互补核苷酸之间的配对。32.如上述任一项权利要求所述的方法，其中所述正向和/或反向引物在至少一个位置含有简并引物。33.如上述任一项权利要求所述的方法，其中所述正向或反向引物在其引物结合位点具有至少一个错配，且提供与所述正向或反向引物结合位点完全互补的第二正向或反向引物，所述第二正向或反向引物的浓度是所述正向或反向引物浓度的0.1至50％。34.如权利要求30,31和33所述的方法，其中所述扩增是在错配稳定剂的存在下进行的。35.如上述任一项权利要求所述的方法，其中所述正向和/或反向引物的5’端连接有人工序列连接链段，所述人工序列连接链段具有与所述正向或反向引物相同的非充分核苷酸类型，其5’端被连接有5’链段，所述5’链段包括四种标准核苷酸类型且与目标核酸互补。36.如权利要求1-34任一项所述的方法，其中所述正向和/或反向引物是5’端连接有人工链段的引物链段，所述人工链段具有与所述引物链段相同的非充分核苷酸类型，扩增是采用接合引物进行的，所述接合引物包括目标物结合位点以及所述人工链段的互补链；且所述接合引物的目标物结合位点包括全部四种标准核苷酸。37.如上述任一项权利要求所述的方法，其中所述正向和/或反向引物的5’端连接有双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸的其中一条链具有与其连接的引物相同的非充分核苷酸类型，其中所述人工双链寡核苷酸的熔融温度不同于由正向和反向引物延伸而形成的主要扩增产物的熔融温度；其中主要扩增产物的形成通过熔融曲线分析监测，其中主要熔融温度转变为从人工双链寡核苷酸的熔融温度转变至主要扩增产物的熔融温度。38.如权利要求37所述的方法，其是采用多对正向和/或反向引物多重进行的，不同的引物连接到具有不同温度的不同人工链段。39.如权利要求1-36任一项所述的方法，其中所述正向和/或反向引物的5’端连接有人工寡核苷酸序列，所述人工寡核苷酸序列具有与其连接的引...

【专利技术属性】
技术研发人员：王友祥，杨志杰，陈欣，
申请(专利权)人：阿提拉生物系统公司，
类型：发明
国别省市：美国,US