用于评估无细胞DNA的多重优化错配扩增(MOMA)实时PCR制造技术

本发明专利技术涉及用于评估例如来自对象的样品中非天然核酸的量的方法和组合物。本文中提供的方法和组合物可用于确定对象中例如移植排斥的病症的风险。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于评估无细胞DNA的多重优化错配扩增(MOMA)实时PCR相关申请本申请依据35U.S.C.119(e)要求于2015年4月30日提交的美国临时申请62/155,453的申请日权益，其内容通过引用整体并入本文。
本专利技术涉及用于评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法和组合物。本文中提供的方法和组合物可用于确定例如移植排斥的病症的风险。本专利技术还涉及用于使用多重优化错配扩增(multiplexedoptimizedmismatchamplification，MOMA)来评估非天然无细胞脱氧核糖核酸(非天然无细胞DNA，例如供体特异性无细胞DNA)的量的方法和组合物。技术背景检测并量化样品中非天然核酸的能力可允许早期检测例如移植排斥的病症。然而，当前用于定量分析异质核酸群(例如，天然和非天然核酸的混合物)的方法是受限的。专利技术概述本公开内容至少部分地基于以下令人惊讶的发现：可使用多重优化错配扩增来量化来自对象的样品中的低频率非天然核酸。多重优化错配扩增包括引物的设计，所述引物可包含用于扩增特定序列的3’倒数第二位错配，和相对于另一序列的双错配。用这样的引物进行扩增可允许定量地确定样品中非天然核酸的量，甚至在非天然核酸的量在异质核酸群中为例如1％或甚至0.5％以下的情况下也如此。本文中提供了与这样的经优化扩增相关的方法、组合物和试剂盒。所述方法、组合物或试剂盒可以是本文中分别提供的任一种方法、组合物或试剂盒，包括实例和附图中的那些中的任一种。在一个方面，提供了一种评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：对于多种单核苷酸变体(singlenucleotidevariant，SNV)靶标中的每一种，用至少一种引物对对样品或其部分获得来自基于扩增的定量测定(例如聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)定量测定)的结果，其中所述至少一种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少一种引物对包含具有相对于SNV靶标之一种序列(例如，等位基因)的3’错配(例如，倒数第二位错配)而相对于SNV靶标之另一种序列(例如，等位基因)的3’双错配的引物，并且特异性地扩增SNV靶标的这一种序列(例如，等位基因)。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括：对于每种SNV靶标，用至少一种另一引物对获得来自定量测定的结果，其中所述至少一种另一引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少一种另一引物特异性地扩增SNV靶标的另一种序列(例如，等位基因)。在一个实施方案中，提供了一种评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法：对于多种单核苷酸变体(SNV)靶标中的每一种，用至少两种引物对对样品或其部分进行基于扩增的定量测定(例如PCR定量测定)，其中每种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少两种引物对中的一种包含相对于SNV靶标之一种序列(例如，等位基因)的3’错配(例如，倒数第二位)而相对于SNV靶标之另一种序列(例如，等位基因)的3’双错配且特异性地扩增SNV靶标的这一种序列(例如，等位基因)，并且所述至少两种引物对中的另一种特异性地扩增SNV靶标的这另一种序列(例如，等位基因)。在一个实施方案中，提供了一种评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法，其包括：对多种单核苷酸变体(SNV)靶标中的每一种获得来自用至少两种引物对对样品或其部分进行基于扩增的定量测定(例如聚合酶链反应(PCR)定量测定)的结果，其中每种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少两种引物对中的一种包含相对于SNV靶标之一种序列(例如，等位基因)的3’错配(例如，倒数第二位)而相对于SNV靶标之另一种序列(例如，等位基因)的3’双错配且特异性地扩增SNV靶标的这一种序列(例如，等位基因)，并且所述至少两种引物对中的另一种特异性地扩增SNV靶标的这另一种序列(例如，等位基因)。在一个实施方案中，提供了一种评估例如来自对象的样品中非天然核酸的量的方法，所述样品包含非天然和天然核酸，所述方法包括：对于多种SNV靶标，对每种这样的SNV靶标用如本文中提供的至少一种引物对(例如至少两种引物对)对样品获得来自基于扩增的定量测定(例如聚合酶链反应(PCR)测定)的结果，其中每种引物对包含正向引物和反向引物；基于天然核酸和/或非天然核酸的基因型来选择信息性结果；以及基于信息性结果来确定样品中非天然核酸的量。在一个实施方案中，所述方法还包括鉴定多种SNV靶标。在一个实施方案中，所述方法还包括推断非天然核酸的基因型。在一个实施方案中，所述方法还包括提供结果。在一个实施方案中，提供了一种评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法，所述方法包括：获得来自以下的结果：1)对于多种SNV靶标中的每一种用至少一种引物对(例如至少两种引物对)对样品或其部分进行基于扩增的定量测定(例如PCR定量测定)，其中每种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少一种引物对，例如至少两种引物对中的一种包含相对于SNV靶标之一种序列(例如，等位基因)的3’错配(例如，倒数第二位)而相对于SNV靶标之另一种序列(例如，等位基因)的3’双错配，并且特异性地扩增SNV靶标的这一种序列(例如，等位基因)；以及2)基于天然基因型和/或对可能的非天然基因型的预测来确定信息性结果。在一个实施方案中，当存在至少两种引物对时，另外的引物对特异性地扩增每种SNV靶标的另一种序列(例如，等位基因)，并且对每种SNV靶标用另外的引物对获得量化结果。在一个实施方案中，一种评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法，所述方法包括获得来自以下的结果：1)对于多种SNV靶标中的每一种，用至少两种引物对对样品或其部分进行基于扩增的定量测定(例如PCR定量测定)，其中每种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少两种引物对中的一种包含相对于SNV靶标之一种序列(例如，等位基因)的3’错配(例如，倒数第二位)而相对于SNV靶标之另一种序列(例如，等位基因)的3’双错配且特异性地扩增SNV靶标的这一种序列(例如，等位基因)，并且所述至少两种引物对中的另一种特异性地扩增SNV靶标的这另一种序列(例如，等位基因)；以及2)基于天然基因型和/或对可能的非天然基因型的预测来确定信息性结果。在本文中提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一个实施方案中，还包括用于每种SNV靶标的至少一种另一种引物对，和/或用其获得基于扩增的定量测定(例如PCR定量测定)的结果。在本文中提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一个实施方案中，所述至少另一种引物对包含相对于SNV靶标之另一种序列(例如，等位基因)的3’错配(例如，倒数第二位)而相对于SNV靶标之一种序列(例如，等位基因)的3’双错配，并且特异性地扩增SNV靶标的这另一种序列(例如，等位基因)。在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括基于结果来评估非天然核酸的量。在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述结果是信息性结果。在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括选择基于扩增的定量测定(例如PCR定量测定)的信息性结果。在提供的任一种方法的一个实施方案中，对选择的信息性结果求平均。在提供的任一种方法的一个实施方案中，基于非本文档来自技高网...

【技术保护点】
评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法，所述样品包含非天然和天然核酸，所述方法包括：对于多种单核苷酸变体(SNV)靶标中的每一种，用至少两种引物对对所述样品或其部分进行基于扩增的定量测定，其中每种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少两种引物对中的一种在引物中包含相对于所述SNV靶标之一种等位基因的3’倒数第二位错配而相对于所述SNV靶标之另一种等位基因的3’双错配且特异性地扩增所述SNV靶标的所述一种等位基因，并且所述至少两种引物对中的另一种特异性地扩增所述SNV靶标的所述另一种等位基因，以及获得或提供来自所述基于扩增的定量测定的结果以确定所述样品中非天然核酸的量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.30 US 62/155,4531.评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法，所述样品包含非天然和天然核酸，所述方法包括：对于多种单核苷酸变体(SNV)靶标中的每一种，用至少两种引物对对所述样品或其部分进行基于扩增的定量测定，其中每种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少两种引物对中的一种在引物中包含相对于所述SNV靶标之一种等位基因的3’倒数第二位错配而相对于所述SNV靶标之另一种等位基因的3’双错配且特异性地扩增所述SNV靶标的所述一种等位基因，并且所述至少两种引物对中的另一种特异性地扩增所述SNV靶标的所述另一种等位基因，以及获得或提供来自所述基于扩增的定量测定的结果以确定所述样品中非天然核酸的量。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述结果在报告中提供。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法还包括基于所述结果来确定所述样品中所述非天然核酸的量。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述结果包含所述样品中所述非天然核酸的量。5.评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法，所述样品包含非天然和天然核酸，所述方法包括：获得来自对于多种单核苷酸变体(SNV)靶标中的每一种用至少两种引物对对所述样品或其部分进行基于扩增的定量测定的结果，其中每种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少两种引物对中的一种在引物中包含相对于所述SNV靶标之一种等位基因的3’倒数第二位错配而相对于所述SNV靶标之另一种等位基因的3’双错配且特异性地扩增所述SNV靶标的所述一种等位基因，并且所述至少两种引物对中的另一种特异性地扩增所述SNV靶标的所述另一种等位基因；以及基于所述结果来评估非天然核酸的量。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述样品中所述非天然核酸的量基于所述基于扩增的定量测定的所述结果。7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述结果从报告获得。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少两种引物对中的另一种引物对也在引物中包含相对于所述SNV靶标之所述另一种等位基因的3’倒数第二位错配而相对于所述SNV靶标之所述一种等位基因的3’双错配，并且特异性地扩增所述SNV靶标的所述另一种等位基因。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述量是非天然核酸与天然核酸的比例或百分比。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结果是所述基于扩增的定量测定的信息性结果。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述量基于所述基于扩增的定量测定的信息性结果。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括选择所述基于扩增的定量测定的信息性结果。13.根据权利要求12所述的方法，其中对所选的信息性结果求平均。14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述基于扩增的定量测定的所述信息性结果基于所述非天然核酸和/或天然核酸的基因型来选择。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括获得所述非天然核酸和/或天然核酸的基因型。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括获得所述多种SNV靶标。17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括获得所述多种SNV靶标中每一种的所述至少两种引物对。18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多种SNV靶标为至少90种SNV靶标。19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多种SNV靶标为至少95种SNV靶标。20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多种SNV靶标为少于105种SNV靶标。21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多种SNV靶标为少于100种SNV靶标。22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品中非天然核酸的量为至少0.005％。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述样品中非天然核酸的量为至少0.01％。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述样品中非天然核酸的量为至少0.03％。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述样品中非天然核酸的量为至少0.05％。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述样品中非天然核酸的量为至少0.1％。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述样品中非天然核酸的量为至少0.3％。28.根据权利要求22至27中任一项所述的方法，其中所述样品中非天然核酸的量为少于1.5％。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述样品中非天然核酸的量为少于1.3％。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述样品中非天然核酸的量为少于1％。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述样品中非天然核酸的量为少于0.5％。32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当不知道或未获得所述非天然核酸的基因型时，所述方法还包括：基于对可能的非天然基因型的预测来评估结果。33.根据权利要求32所述的方法，其中所述评估用期望-最大化算法进行。34.评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法，所述样品包含非天然和天然核酸，所述方法包括：获得来自以下的结果：1)对于多种SNV靶标中的每一种，用至少两种引物对对样品或其部分进行基于扩增的定量测定，其中每种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少两种引物对中的一种在引物中包含相对于所述SNV靶标之一种等位基因的3’倒数第二位错配而相对于所述SNV靶标之另一种等位基因的3’双错配且特异性地扩增所述SNV靶标的所述一种等位基因，并且所述至少两种引物对中的另一种特异性地扩增所述SNV靶标的所述另一种等位基因，和2)基于天然基因型和对可能的非天然基因型的预测来确定信息性结果；以及提供所述结果以确定所述样品中非天然核酸的量。35.根据权利要求34所述的方法，其中所述结果在报告中提供。36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述方法还包括基于所述结果来确定所述样品中非天然核酸的量。37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中所述结果包含所述样品中所述非天然核酸的量。38.评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法，所述样品包含非天然和天然核酸，所述方法包括：获得来自以下的结果：1)对于多种SNV靶标中的每一种，用至少两种引物对对样品或其部分进行基于扩增的定量测定，其中每种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少两种引物对中的一种在引物中包含相对于所述SNV靶标之一种等位基因的3’倒数第二位错配而相对于所述SNV靶标之另一种等位基因的3’双错配且特异性地扩增所述SNV靶标的所述一种等位基因，并且所述至少两种引物对中的另一种特异性地扩增所述SNV靶标的所述另一种等位基因，和2)基于天然基因型和对可能的非天然基因型的预测来确定信息性结果；以及基于所述结果来评估非天然核酸的量。39.根据权利要求38所述的方法，其中所述样品中所述非天然核酸的量基于所述基于扩增的定量测定的所述结果。40.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述结果从报告获得。41.根据权利要求34至40中任一项所述的方法，其中所述方法还包括基于天然基因型和对可能的非天然基因型的预测来选择信息性结果。42.根据权利要求34至41中任一项所述的方法，其中使用期望-最大化来预测可能的非天然基因型。43.根据权利要求34至42中任一项所述的方法，其中所述至少两种引物对中的另一种引物对也在引物中包含相对于所述SNV靶标之所述另一种等位基因的3’倒数第二位错配而相对于所述SNV靶标之所述一种等位基因的3’双错配，并且特异性地扩增所述SNV靶标的所述另一种等位基因。44.根据权利要求34至43中任一项所述的方法，其中所述量是非天然核酸与天然核酸的比例或百分比。45.根据权利要求34至44中任一项所述的方法，其中所述方法还包括获得所述天然核酸的基因型。46.根据权利要求34至45中任一项所述的方法，其中所述方法还包括获得所述多种SNV靶标。47.根据权利要求34至46中任一项所述的方法，其中所述方法还包括获得所述多种SNV靶标中每一种的所述至少两种引物对。48.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用最大似然来计算非天然核酸的量。49.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品包含无细胞DNA样品，并且所述量是非天然无细胞DNA的量。50.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述对象是移植接受者，并且非天然核酸的量是供体特异性无细胞DNA的量。51.根据权利要求50所述的方法，其中所述移植接受者是心脏移植接受者。52.根据权利要求50或51所述的方法，其中所述移植接受者是儿科移植接受者。53.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个的基于扩增的定量测定是定量PCR测定，例如实时PCR测定或数字PCR测...

【专利技术属性】
技术研发人员：青·富田·米切尔，迈克尔·米切尔，卡尔·斯塔姆，
申请(专利权)人：威斯康星州立大学医学院，
类型：发明
国别省市：美国,US