具有增强的3’-错配辨别力的DNA聚合酶制造技术

公开了相对于对应的未修饰的聚合酶具有增强的3′-错配辨识力的突变型DNA聚合酶。突变型聚合酶可用于多种公开的引物延伸方法中。还公开了相关的组合物，包括可用于，例如，突变型DNA聚合酶生产的重组核酸、载体以及宿主细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有增强的3’ -错配辨别力的DNA聚合酶专利
本专利技术提供了具有增强的3’ -错配辨别力的DNA聚合酶及它们在各种应用，包括核酸多核苷酸延伸和扩增中的用途。专利技术背景DNA聚合酶负责基因组的复制和维护，这是在世代间(from generation to generation)精确传递遗传信息的中心职责。DNA聚合酶在细胞中的功能是作为负责DNA 合成的酶。它们在有金属活化剂如Mg2+存在的情况下，以被复制的DNA模板或多核苷酸模板支配的顺序聚合脱氧核糖核苷三磷酸。在体内，DNA聚合酶参与一系列DNA合成过程，包括DNA复制、DNA修复、重组和基因扩增。在每一 DNA合成过程期间，复制DNA模板一次或最多几次以产生相同的复制品。与此相反，在体外，DNA复制可以重复多次，例如在聚合酶链式反应期间(参见例如美国专利号4，683，202)。在聚合酶链式反应(PCR)的最初研究中，DNA聚合酶是在每一轮DNA复制的开始时添加的(参见上述美国专利号4，683，202)。后来，确认了从在高温下生长的细菌中可获得热稳定DNA聚合酶，这些酶只需要添加一次(参见美国专利号4，889，818和美国专利号 4，965，188)。在PCR期间使用的高温下，这些酶没有不可逆地失活。因此，可以进行聚合酶链式反应的重复循环而不需要在每一合成加成过程开始时添加新鲜的酶。DNA聚合酶特别是热稳定聚合酶，是重组DNA研究和疾病的医疗诊断中大量技术的关键。特别是对于诊断应用，目标核酸序列可能仅仅是所考察(in question)DNA或RNA的一小部分，因此在不扩增的情况下可能难以检测到目标核酸序列的存在。DNA聚合酶的总体折叠模式类似人的右手，包含手掌、手指和拇指三个独特的亚结构域。(参见 beese 等，Science 260:352-355, 1993) ;Patel 等，Biochemistry 34:5351-5363, 1995)。尽管在大小和细胞功能不同的聚合酶之间手指和拇指亚结构域的结构变化很大，但是催化性的手掌亚结构域全部都是重叠的(superimposable)。例如，在化学催化作用期间与引入的dNTP相互作用并稳定过渡态的基序A在哺乳动物ρο α和原核生物的Pol I家族DNA聚合酶之间是重叠的，平均偏差约为IA (Wang等，Cell 89:1087 -1099，1997)。在结构上基序A以主要包含疏水性残基的反向平行β-折叠链起始，延续·到α-螺旋。DNA聚合酶活性位点的主要氨基酸序列是特别保守的。在基序A的情况下，例如，序列DYSQIELR(SEQ ID NO:28)保留在从数百万年进化分离的生物体包括例如水生栖热菌 iThormus aquaticus)、沙眼衣原体{Chlamydia trachomatis)和大肠杆菌 ipscherichia coli)的聚合酶中。除了高度保守以外，DNA聚合酶的活性位点也被证明是相对易变的，能够容纳某些的氨基酸取代而不显著降低DNA聚合酶活性。(参见例如美国专利号6，602，695)。这种突变型DNA聚合酶可以在例如包括核酸合成反应的诊断和研究应用中提供各种选择优势。因此，本领域需要鉴别适于突变的氨基酸位置以产生改进的聚合酶活性。本专利技术，如同本文中所述，满足这些及其它需要。专利技术概述本文提供了相对于对应的未修饰的对照聚合酶具有增强的3’ -错配辨别力的DNA聚合酶以及制备和使用这种DNA聚合酶的方法。在一些实施方案中，聚合酶是热稳定DNA聚合酶。在一些实施方案中，DNA聚合酶是热活性的DNA聚合酶。在一些实施方案中，DNA聚合酶源自栖热菌种species)。在一些实施方案中，DNA聚合酶源自栖热袍菌种 {Thermotoga species)。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的488位的DNA聚合酶的氨基酸是除S以外的任何氨基酸，除了对应于SEQ ID NO:1的488位的对照DNA聚合酶的氨基酸是S，对照DNA聚合酶具有与所述DNA聚合酶相同的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的488位的位置处的氨基酸选自G，A, V, L, I, M, F，W, P, T, C，Y, N, Q, D, E, K, R或H。在一些实施方案中，对应于SEQ ID N0:1的488位的位置处的氨基酸选自G，A, D, F，K, C，T,或Y。在一些实施方案中，本专利技术的DNA聚合酶源自栖热菌种，对应于SEQ ID N0:1的 488位的氨基酸是在中性pH时，具有极性、不带电荷的侧链的氨基酸(除了 S，例如，N，Q, H, T或Y)，具有非极性、不带电荷的侧链的氨基酸(例如，G，A, L, M, W, P, F，C，V或 I)，具有极性、带负电荷的侧链的氨基酸(例如，D或E)，或具有极性、带正电荷的侧链的氨基酸(例如，R或K)。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的488位的具有极性的、不带电荷的侧链的氨基酸是T或Y ;对应于SEQ ID NO:1的488位的具有非极性的、不带电荷的侧链的氨基酸是A，F，G，或C ;对应于SEQ ID NO:1的488位的具有极性的、带负电荷的侧链的氨基酸是D ;以及对应于SEQ ID NO:1的488位的具有极性的、带正电荷的侧链的氨基酸是K。而且，根据本专利技术，位于对应于SEQ ID NO:1的488位的氨基酸附近的其它氨基酸也可以被突变，以产生相对于对应的未修饰的对照聚合酶具有增强的3’ -错配辨别力的酶。例如，对应于SEQ ID NO:1的493和/或497位的氨基酸的突变也产生相对于对应的未修饰的对照聚合酶具有增强的3’ -错配辨别力的酶。在一些实施方案中，具有增强的3’ -错配辨别力的DNA聚合酶在聚合酶结构域中包含基序，所述基序 包含A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Q-X9-X10-X11-X12-L-X13-X14-X15-L,其中XI是 H，E 或 Q;X2 是 P，T 或 E;X3是N或H ;X4是L或I ;X5是N或R ;X6是除S以外的任何氨基酸；X7 是 R，P，或 S ;X8 是〕，K 或 T;X9是L或V ;X10 ^ E, S，A 或 G;XII是 R，N, Y, T 或V;X12是V或I ;X13是F或Y ;X14是0或E ;和X15是￡ 或K (SEQ ID NO:8)。在一些实施方案中，X6选自 G，A, V, L, I, M, F，W, P, T, C，Y, N, Q, D, E, K, R 或 H (SEQ ID NO:49)。在一些实施方案中，具有增强的3’-错配辨别力的DNA聚合酶在聚合酶结构域中包含基序，所述基序包含A-G-X1-P-F-N-X4-N-X6-X7-X8-Q-X9-X10-X1J-X12-L-F-X14-X1S-L,其中X1是H或EjPX4是L或I ;X6是除S以外的任何氨基酸X7是R或PX8是D或KX9是L或VXltl是E或SX1A R 或NX12是V或IX14是D或E和X15是E或K(SEQ ID NO:9)ο在一些实施方案中，具有增强的3’-错配辨别力的DNA聚合酶在聚合酶结构域中包含基序，所述基序本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：F赖切特，K鲍尔，TW迈尔斯，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：
国别省市：