一种新型的基因定量检测方法组合物、试剂盒和方法技术

本发明专利技术涉及一种新型的目标基因定量检测方法padlock‑RCA‑ELISA法。本发明专利技术还涉及用所述方法进行动物组织中不同动物来源生长激素基因相对定量（猪和牛）以及线粒体细胞色素b基因相对定量（猪和牛）的寡核苷酸探针组合物。本发明专利技术还涉及包含所述组合物的padlock‑RCA‑ELISA试剂盒。使用本发明专利技术的方法，能够简单、快速、准确地对目标基因进行定量检测。

A new method for quantitative detection of genes, compositions, kits and methods

The invention relates to a method of detecting target gene quantitative model padlock RCA ELISA. The invention also relates to the oligonucleotide probe composition for relative quantification of pig growth hormone gene (pig and cattle) and mitochondrial cytochrome b gene (pig and cattle) in animal tissues by using the method. The invention also relates to padlock RCA ELISA kits comprising such compositions. The method of the present invention can be used to detect the target gene in a simple, fast and accurate way.

【技术实现步骤摘要】
一种新型的基因定量检测方法组合物、试剂盒和方法
本专利技术属于生物
，具体而言，本专利技术涉及一种新型的基因定量检测方法-padlock-RCA-ELISA法，以及用所述方法进行动物组织中不同动物来源生长激素基因相对定量（猪和牛）以及线粒体细胞色素基因相对定量（猪和牛）的寡核苷酸探针组合物。还涉及包含所述组合物的padlock-RCA-ELISA试剂盒。
技术介绍
基因定量检测在医疗诊断、传染病原监测、法医、食品安全中应用广泛。目前常见的方法是实时荧光定量PCR，最新的技术室数字化PCR。这些方法均需以PCR技术为基础，通过对目标基因在分子拷贝数上的放大来实现信号的检测。虽然该类技术灵敏准确，但需要依赖昂贵的仪器和试剂，难以满足现场或基层实验室的检测需求。本方法名为padlock-RCA-ELISA，通过将锁式探针和滚环复制技术结合，实现对目标基因分子的原位放大，配合传统ELISA技术，通过微孔板固相捕获和酶联探针检测来获取目标基因的信号。该方法基于基因分子等温条件下的滚环复制原理，无需复杂的变温程序，因此在常规等温条件下即可操作。通过设定标准样品，可以通过类似ELISA的流程来实现目标基因的定量检测。
技术实现思路
本专利技术提供了padlock-RCA-ELISA检测方法，该方法采用基于padlock探针的RCA技术，设计针对猪和牛生长激素基因及细胞色素b基因的特异性padlock探针，在液相环境中完成探针对相应基因序列的识别和成环连接，通过固定在ELISA板上的捕获探针捕获padlock环，利用带报告基团标记的检测探针与固相RCA滚环复制产物进行结合，最后在酶标仪通过检测探针的报告基团标记鉴定序列。本专利技术的方法在常规操作和等温条件下进行目标基因定量检测，突破实时荧光PCR方法和数字化PCR昂贵的成本限制。在本专利技术的一个方面，提供了检测牛和猪源性生长激素基因的特异性牛padlock1寡核苷酸探针SEQIDNo.1（5’AGCTTTGGGCTTTAGATCCTCAATGCTGCTGCTGTACTACCAATAGAGGTACAGTGAATGCGAGTCCGTCTCGATGGATGTGTTCAG3’）和特异性猪padlock1寡核苷酸探针SEQIDNo.2（5’AACCTTGGGCTTTGCTTCTAATCCTCAATGCTGCTGCTTTACTAGTGCTGGATGATCGTCCCTTCTCGGATGGGGCACC3’）。在所述两个序列的5’端是磷酸基团。该padlock1探针分别识别牛和猪生长激素基因的DNA序列，并使其连接成环。另外，提供了检测牛和猪源性细胞色素b基因的特异性牛padlock1寡核苷酸探针SEQIDNo.3（5’ATCCGATACATACACGCCAAGAAATCCTCAATGCTGCTAGGTTCCAGTGAATGCGAGTCCGTCTCAGAAAGAACTACGGCTGAATC3’）和特异性猪padlock1寡核苷酸探针SEQIDNo.4（5’ATTCGCTATCTACATGCTCGTCAATCCTCAATGCTGCTAAAAGACTAGTGCTGGATGATCGTCCCAAGAAGTAAATTACGGATGAGTT3’）。在所述两个序列的5’端是磷酸基团。该padlock1探针分别识别牛和猪细胞色素b基因的DNA序列，并使其连接成环。在本专利技术的一个方面，提供了牛生长激素基因模板SEQIDNo.5（5’GTTCACATTCGGAAGCCCTAAAGCCCAAAGCTCTGAACACATCCATCGGCAGGG3’）和猪生长激素基因模板SEQIDNo.6（5’GCTCACATTCGGAAGCCCCAAAGCCCAAGGTTGGTGCCCCATCCGTCTGCATGG3’），该DNA模板分别与牛和猪生长激素基因酶切产物序列相同。同时提供了牛细胞色素b基因模板SEQIDNo.7（5’AGCTCCGTTTGCGTGTATGTATCGGATGATTCAGCCGTAGTTCACGTCTCGGCAG3’）和猪细胞色素b基因模板SEQIDNo.8（5’CTCCGTTTGCATGTAGATAGCGAATAACTCATCCGTAATTTACGTCTCGACAAAT3’），该DNA模板分别与牛和猪细胞色素b基因酶切产物序列相同。在本专利技术的一个方面，还提供了生长激素基因和细胞色素b基因通用捕获探针序列SEQIDNo.9（5’AAAAAAAAAAGTACAGCAGCAGCATTGAGGAT3’）。在捕获探针5’端连接有能够使其固定在固相上的连接分子，例如生物素。通过该捕获探针，使连接成环的DNA序列富集在固相上，例如固定在链霉亲和素包被的酶标板上。在本专利技术的一个方面，还提供了牛生长激素基因与细胞色素b基因通用padlock2寡核苷酸探针SEQIDNo.10（5’ATGATCGTCCTTATCACTGCCCCGACAGGCCTCAGACATCATAATAGCTCCTAGTGCTGG33’）和猪生长激素基因与细胞色素b基因通用padlock2寡核苷酸探针SEQIDNo.11（5’GAGTCCGTCTTTATCACTGCCCCGACAGGCCTCAGACATCATAATAGCTCCAGTGAATGC3’）在所述两个序列的5’端是磷酸基团。该padlock2探针分别识别牛和猪生长激素基因或细胞色素b基因RCA产物的DNA序列，并使其二次连接成环。在本专利技术的一个方面，还提供了对二次成环产物滚环复制的通用寡核苷酸探针SEQIDNo.12（5’GATGTCTGAGGC3’）。该探针可将二次连接成环DNA进行二次滚环复制，放大检测信号。在本专利技术的一个方面，还提供了牛检测探针序列SEQIDNo.13（5’CAGTGAATGCGAGTCCGTCTUUUU3’）和猪检测探针序列SEQIDNo.14（5’CTAGTGCTGGATGATCGTCCUUUU-3’），在所述两种检测探针的5’端均连接有报告基团，例如HRP标记。该检测序列与固相上的成环DNA序列进行特异性连接，用于在酶标仪通过检测探针的报告基团标记鉴定序列。在本专利技术的另一个方面，提供了用于牛和猪生长激素基因和细胞色素b基因定量检测的padlock-RCA-ELISA试剂盒，所述试剂盒中包含所述寡核苷酸序列或所述组合物。本专利技术提供的试剂盒包括本专利技术的用padlock-RCA-ELISA方法定量检测牛和猪生长激素基因和细胞色素b基因的使用说明书。在一个实施方案中，本专利技术的牛肉和猪肉特异性padlock探针分别根据牛和猪的生长激素基因和细胞色素b基因序列设计。在一个实施方案中，所述试剂盒中包含牛生长激素基因padlock1探针靶序列为GHpadlock1cow:5’AGCTTTGGGCTTTAGATCCTCAATGCTGCTGCTGTACTACCAATAGAGGTACAGTGAATGCGAGTCCGTCTCGATGGATGTGTTCAG3’(SEQIDNo.1)，猪生长激素基因padlock1探针靶序列为GHpadlock1pig:5’AACCTTGGGCTTTGCTTCTAATCCTCAATGCTGCTGCTTTACTAGTGCTGGATGATCGTCCCTTCTCG本文档来自技高网...

【技术保护点】
通过padlock‑RCA‑ELISA检测方法检测牛和猪生长激素基因和细胞色素b基因的组合物，所述组合物包含牛生长激素基因padlock1探针SEQ ID No.1、猪生长激素基因padlock1探针SEQ ID No.2、牛细胞色素b基因padlock1探针SEQ ID No.3、猪细胞色素b基因padlock1探针SEQ ID No.4、牛生长激素基因模板SEQ ID No.5、猪生长激素基因模板SEQ ID No.6、牛细胞色素b基因模板SEQ ID No.7、猪细胞色素b基因模板SEQ ID No.8、通用捕获探针序列SEQ ID No.9、牛通用padlock2探针SEQ ID No.10、猪通用padlock2探针SEQ ID No.11、通用二次滚环通用探针SEQ ID No.12、牛通用检测探针序列SEQ ID No.13、猪通用检测探针序列SEQ ID No.14；其中在padlock探针序列5’端有磷酸化修饰，在捕获探针序列5’端连接有生物素，在检测探针5’端连接有HRPMT标记。

【技术特征摘要】
1.通过padlock-RCA-ELISA检测方法检测牛和猪生长激素基因和细胞色素b基因的组合物，所述组合物包含牛生长激素基因padlock1探针SEQIDNo.1、猪生长激素基因padlock1探针SEQIDNo.2、牛细胞色素b基因padlock1探针SEQIDNo.3、猪细胞色素b基因padlock1探针SEQIDNo.4、牛生长激素基因模板SEQIDNo.5、猪生长激素基因模板SEQIDNo.6、牛细胞色素b基因模板SEQIDNo.7、猪细胞色素b基因模板SEQIDNo.8、通用捕获探针序列SEQIDNo.9、牛通用padlock2探针SEQIDNo.10、猪通用padlock2探针SEQIDNo.11、通用二次滚环通用探针SEQIDNo.12、牛通用检测探针序列SEQIDNo.13、猪通用检测探针序列SEQIDNo.14；其中在padlock探针序列5’端有磷酸化修饰，在捕获探针序列5’端连接有生物素，在检测探针5’端连接有HRPMT标记。2.根据权利要求1所述的组合物，牛和猪的检测探针的5’端标记HRPMT。3.用于基于padlock-RCA-ELISA检测方法鉴别牛和猪生长激素基因和细胞色素b基因的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的组合物。4.检测牛和猪生长激素基因和细胞色素b基因的padlock-RCA-ELISA检测方法，所述方法包括使用权利要求1或2所述的组合物或...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴亚君，陈磊，陈颖，刘鸣畅，杨艳歌，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11